CX004L EdU-647细胞增殖检测试剂盒

规格 ：200~2000次

EdU-647细胞增殖检测试剂盒
EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 647
本产品冰袋运输；-20℃避光保存，保质期12个月。

货号规格
goodCX004L    50~500次
goodCX004L    200~2000次

产品内容
 

组分名称	CX004	CX004L
EdU(10mM)	200 μL	800 μL
647 Azide	55 μL	220 μL
Click Reaction Buffer	30 mL	120 mL
CuSO4	1.5 mL	6 mL
Click Additive	2管	1瓶
Hoechst 33342(1000×)	50 μL	200 μL

产品特点
gd反应简单——基于简单高效的点击反应，无需DNA变性；
gd灵敏度高——只需少量的小分子叠氮化物探针即可非常有效地标记出掺入的EdU，并且可以检测到单个细胞的增殖情况；
gd操作便捷——只需常用的多聚甲固定和Triton X-100穿透，就可以使叠氮化物探针有效进入细胞并发生点击反应；
gd兼容性好——不影响细胞形态，也不会影响后续的免疫荧光和免疫组化检测，以及DNA的荧光染色。

产品简介
good本产品通过在DNA合成过程中掺入胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)，并在随后的点击反应(Click reaction)中将EdU标记上荧光染料Alexa Fluor 647，从而实现对细胞增殖进行简单、快速、高灵敏的检测。检测的对象包括培养的细胞或组织样品，也可检测组织切片。经试剂盒处理后的增殖细胞会发出较强的远红外荧光，可被多种成像系统(如激光共聚焦显微镜等)或有相应激发和发射检测模块的流式细胞仪或荧光酶标仪所检测到，也可进行高内涵筛选(High-Content Screening，HCS)。需注意的是，流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品，不可用于组织切片。
good本试剂盒包含EdU法检测所需的所有试剂组分，除检测细胞增殖外，还可用于细胞周期分析，为此，试剂盒中提供了蓝色细胞核染料Hoechst 33342。

 

产品简介

 

小鼠腹腔注射EdU-647 4h后检测多种组织器官的细胞增殖实例

 

自备试剂
 

缓冲液	推荐配方
固定液	4%的多聚甲quan
洗涤液	含3% BSA的PBS
通透液	含0.3% Triton X-100的PBS

操作步骤
good◈  细胞的EdU标记
good◈  如下步骤以6孔板检测体系为例，如使用其它型号培养板，检测体系可以按相应比例调整。
good◈goo1. 在6孔板中(如有必要可以放入盖玻片)培养适量细胞。待细胞培养过夜且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等； 
good◈goo2. 配制2×EdU工作液：推荐EdU终浓度为10 μM(1×)，用细胞培养液1:500稀释EdU(10 mM)即可得到2×EdU工作液(20 μM)；
good◈goo2. 注：◎  对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EdU的使用终浓度为10 μM(1×)。但细胞类型、培养液种类、细胞密度以及细胞增殖速度等多方面因素都会影响EdU掺入到细胞中的效率，故初次使用时建议进行预实验以确定EdU的最佳使用浓度； 
good◈goo2. 注：◎  由于EdU工作液需与培养液等体积加入培养板中，故需要配制成2×工作液。
good◈goo3. 将37℃预热的2×EdU工作液(20 μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1×。例如设计终浓度为10 μM，原先6孔板中的培养基为1 mL，则只需将1 mL 2×的EdU工作液(20 μM)加入到孔板中即可；
good◈goo2. 注：◎  如果培养基体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2×EdU工作液；
good◈gddoddddddo2. 或者可以减少工作液的体积并提高EdU的浓度，使最终培养液中的EdU浓度为10 μM，

good◈goddddddddo2. 例如2 mL培养液中加入220 μL 0.1 mM EdU；
good◈goo2. 注：◎  不建议替换所有的培养液，以免对细胞的增殖造成影响。 
good◈goo4. 继续孵育细胞2 h。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常继续孵育时间以细胞周期10%左右为宜；
good◈goo2. 注：◎  对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期约为18~25 h，孵育时间以2 h左右为宜；
good◈goo2. 注：◎  人胚胎细胞的细胞周期约为30 min，推荐孵育时间为5 min；
good◈goo2. 注：◎  酵母细胞的细胞周期约3 h，推荐孵育时间为20 min；
good◈goo2. 注：◎  对于增殖的神经细胞，细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天；
good◈goo2. 注：◎  当孵育时间小于45 min时，建议提高EdU的浓度；如孵育时间大于20 h，则建议适当降低EdU的浓度。
good◈goo5. 细胞的EdU标记完成后，吸弃培养液，并加入1 mL 固定液 ，室温固定15 min；
good◈goo2. 注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。
good◈goo6. 去除 固定液 ，每孔加入1 mL 洗涤液 洗涤细胞3次，每次3~5 min；
good◈goo7. 去除 洗涤液 ，每孔加入1 mL 通透液 ，室温孵育10~15 min；
good◈goo8. 去除 通透液 ，每孔用 1mL 洗涤液洗涤细胞1~2次，每次3~5 min；
good◈goo9. 转至步骤 EdU检测；

good◈  动物体内的EdU标记
good◈  EdU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例，其它动物体内的EdU标记请参考相关文献。
good◈goo1. 参照每千克体重10~200 mg Edu用量，使用PBS将Edu配制成合适浓度，并通过腹腔注射、特定组织或器官局部注射、加入饮用水中等方式注入小鼠体内；

good◈goo2. 注：◎  此步骤中 EdU 用量较大，需额外购买(货号：CX000)；

good◈goo2. odd◈g◎  具体用量跟实验动物的种类、体重和 EdU 注入方式有关，可以参考相关文献，建议初次使用时可对 EdU 的用量进行一定的摸索，或者直接按照每千克体重 50 mg 的用量进行测试。

 good◈goo2. odddd◈g如果之前使用过 BrdU 进行实验，则可以按 BrdU 的用量操作。

good◈goo2. 4 h后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时长也可以参考相关文献自行调整；
good◈goo3. 对于冰冻切片：
good◈goo2.（1）加入适量 固定液 ，室温固定15 min；
good◈goo2.（2）去除 固定液 ，用适量 洗涤液 洗涤3次，每次 3~5 min；
good◈goo2.（3）去除 洗涤液 ，用适量 通透液 ，室温孵育 10~15 min；
good◈goo2.（4）去除 通透液 ，用适量 洗涤液 洗涤1~2次，每次 3~5 min；
good◈goo2.（5）抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理；
good◈goo2.（6）转至步骤 EdU检测；
good◈goo4. 对于石蜡切片：
good◈goo2.（1）脱蜡：将石蜡切片置于二甲苯中浸泡10 min；换用新鲜二甲苯再浸泡10 min；更换50%的二甲苯再浸泡5 min；无水乙醇中浸泡5 min；更换新的无水乙醇再浸泡5 min；更换95%乙醇浸泡5 min；更换85%乙醇浸泡5 min；更换75%乙醇浸泡5 min；更换50%乙醇浸泡5 min；更换30%乙醇浸泡5 min；PBS 5 min；
good◈goo2.（2）抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
good◈goo2.（2）注：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
good◈goo2.（3）转至步骤 EdU检测。

good◈  EdU检测
good◈  在以下操作中，6孔板每孔的反应体系为500 µL反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应体系可分别调整为200 µL、100 µL、70 µL、50 µL和20 µL反应混合物。对于较小的孔，单位培养面积的液体用量已经适当增加，以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100~200 µL的反应混合物。
good◈  如下步骤以6孔板中细胞样品为例，对于其它孔板或切片样品，仅需要按比例调整每步溶液的用量，其余步骤相同。

good◈  注：◎  6孔板每孔的反应体系为500 µL反应混合物，对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应体系则可分别调整为200 µL、100 µL、70 µL、50 µL和20 µL反应混合物；

good◈  注：◎  对于较小的培养板孔，单位培养面积的液体用量已经进行过适当增加，可以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响；

good◈  注：◎  如果是切片样本，可以根据其大小，每个切片使用100~200 µL反应混合物。

good◈goo1. 配制Click Additive Solution：对于CX004，用1.5 mL去离子水溶解一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于CX004L，加入12 mL去离子水溶解试剂盒所提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制完成后可以分装保存于-20℃。
good◈goo2. 参考下表配制Click反应液。
good◈goo2. 注：◎  请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；
good◈goo2. 注：◎  Click反应液须在配制后15 min内使用。
 

组分	6孔板样品数
	1	2	4	5	10	25	50
Click Reaction Buffer	430 μL	860 μL	1.72 mL	2.15 mL	4.3 mL	10.75 mL	21.5 mL
CuSO4	20 μL	40 μL	80 μL	100 μL	200 μL	500 μL	1 mL
647 Azide	1 μL	2 μL	4 μL	5 μL	10 μL	25 μL	50 μL
Click Additive Solution	50 μL	100 μL	200 μL	250 μL	500 μL	1.25 mL	2.5 mL
总体积	500 μL	1 mL	2 mL	2.5 mL	5 mL	12.5 mL	25 mL

good◈goo3. 去除上一步骤中的洗涤液；
good◈goo4. 每孔加入0.5 mL Click反应液 ，轻轻摇晃细胞培养板以确保反应混合物将样品均匀覆盖；
good◈goo5. 室温避光孵育30 min，也可酌情适当延长孵育时间；
good◈goo6. 吸除 Click反应液 ，用 洗涤液 洗涤3次，每次3~5 min；
good◈goo7. 如果需要对细胞核进行染色，可以参照步骤 细胞核染色 进行。如无其它的特殊需求，即可在能检测远红外荧光的荧光显微镜下观察，或使用有相应激发和发射检测模块的流式细胞仪、多功能酶标仪等进行荧光检测
。647 Azide的最大激发波长是650 nm，最大发射波长是670 nm；

good◈  细胞核染色
good◈  为了检测细胞增殖比例，可以使用Hoechst 33342进行细胞核染色。此外，高内涵筛选仪器一般也需要对细胞核进行染色。
good◈goo1. 1×Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用1×PBS（货号：PS110）稀释Hoechst 33342(1000×)；
good◈goo2. 接 EdU检测 步骤6，吸除 洗涤液 后，每孔加1×Hoechst 33342溶液1 mL，室温避光孵育10 min；
good◈goo3. 吸除1×Hoechst 33342溶液，用 洗涤液 洗涤3次，每次3~5 min；
good◈goo4. 进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346 nm，最大发射波长为460 nm；

good◈  流式细胞仪检测
good◈  对于经步骤 EdU检测 或 细胞核染色 获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总DNA含量，请在检测过程中使用低流速，实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EdU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标。647 Azide的最大激发波长是650 nm，最大发射波长是670 nm。
good◈goo2. 注：◎  建议使用未经EdU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，并选择合适的电压；
good◈goo2. 注：◎  由于流式细胞仪检测比较灵敏，可根据细胞类型和实际染色情况对647 Azide的使用量进行适当调整。

注意事项
good1. Click Additive配制成溶液后请注意适当分装。如溶解后有白色物质析出，请上下颠倒数次，待其全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，则说明已失效，请弃用；
good2. 本产品完全兼容多种有机染料，如Alexa Fluor^®系列普通染料、fluorescein(FITC)、Allophycocyanin(APC)及APCE-tandems染料；对于Qdot^®纳米晶体探针、Horseradish peroxidase(HRP)、R-phycoerythrin(R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor^®680-R-PE等，需在点击反应完成后进行反应和检测；
good3. 本产品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如Green Fluorescent Protein(GFP)、TC-FlAsH™和TC-ReAsH™类试剂，需在点击反应前进行反应和检测。由于Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，推荐使用Tubulin-Tracker Red进行细胞微管的检测；
good4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
good5. 本产品仅限科研使用。