His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠

库存 ：现货

英文名 ：His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠

保质期 ：1年

供应商 ：恒斐生物

保存条件 ：4°

规格 ：5ml

产品描述

Ni-IDA Magnetic Agarose Beads是由高度交联的4%磁性琼脂糖凝胶为基质，用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。

产品特点

基质	高度交联的4%磁性琼脂糖微球
载量	>10   mg 6xHis蛋白
粒径	30-100μm
储存&稳定性	2‐8℃储存24个月
储存缓冲液	20% 乙醇
体积	5ml(琼脂糖磁珠占20%)

纯化步骤

1.     准备buffer

结合/平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM咪唑，用NaOH 调pH 为8.0

洗涤液: 50mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM咪唑，用NaOH 调pH 为8.0

洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用NaOH 调pH 为8.0

所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

注：上述缓冲液适用多数His标签蛋白纯化，结合/平衡缓冲液中加入一定咪唑有助于降低非特异性结合，用户也可根据实验结果调整缓冲液中的咪唑浓度。

2.     样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 分钟（4000 g）收集菌体，弃上清。

2). 用冷结合/平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要，可加入适量的抑制剂，如蛋白酶抑制剂（PMSF）或其他蛋白酶抑制剂等。

注意：加入的抑制剂不能对Ni-IDA Magnetic Agarose Beads的性能有影响，破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全。

可选：如果裂解物太粘稠，可以加入RNase A （终浓度10 μg/ml） 和DNase I （终浓度5 μg/ml） 并在冰上孵育10-15分钟。

4) 4℃离心20分钟（12,000 g），除菌过滤，并小心将上清和沉淀分离。

5).用SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。

3.   纯化重组His融合蛋白

1). 将Ni-IDA Magnetic Agarose Beads充分混匀，使用移液器取适量的磁珠悬浮液，置于离心管中，磁性分离,弃上清。

2). 加入与上述磁珠悬浮液等体积的平衡缓冲液，使用移液器反复吹打5-10次，磁性分离，弃上清，重复洗涤2次。

3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到处理好的磁珠中，颠倒混匀。将离心管置于混匀仪上，室温孵育30min。(也可置于2-8℃孵育1h或者过夜）

4). 结合结束后，将离心管置于磁力架上，磁性分离，弃上清（保留，以备检测）。向离心管中加入2倍悬浮液体积的洗涤液，移液器反复吹打5-10次，然后磁性分离，用移液器吸取上清（保留，以备取样检测）。重复上述步骤3次。

5). 洗脱蛋白时可根据需要调整洗脱体积从而调整蛋白浓度的目的。建议用2-5 倍柱体积的洗脱缓冲液加入到离心管中，移液器轻轻吹打3-5次，混匀，磁性分离，然后用移液器吸取上清液，即为目的蛋白。如有需要，可以重复上述步骤1次，以提高蛋白回收量。

6). SDS-PAGE检测纯化效果

4.   磁珠处理

1).将装有磁珠的离心管中加入1ml 洗脱缓冲液，用移液器反复吹打3-5次，使磁珠重复悬浮，然后置于磁力架，磁性分离，弃上清，重复该操作2次。向离心管中加入1ml去离子水，用移液器反复吹打3-5次，使磁珠重复悬浮，然后置于磁力架，磁性分离，弃上清，重复该操作2次。最后加入20%乙醇中，使总体积等于初始悬浮液体积，置于 4-8°C 保存。