Pfu DNA Polymerase 高保真PCR聚合酶

库存 ：大量

英文名 ：Dongshengbio

供应商 ：东盛生物

保质期 ：2年

保存条件 ：-20℃

规格 ：250U/250U+dNTP/1000U/1000U+dNTP

Pfu DNA Polymerase

 

产品组分

P1021

Pfu DNA Polymerase 5 U/μl 50μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus） 1.25 ml

6×Loading Buffer 1 ml

 

P1022

Pfu DNA Polymerase 5 U/μl 50 μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus） 1.25 ml

dNTPs（各2.5 mM） 1 ml

6×Loading Buffer 1 ml

 

P 1023

Pfu DNA Polymerase 5 U/μl 200 μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus） 1.25 ml×2

6×Loading Buffer 1 ml

 

P 1024

Pfu DNA Polymerase 5 U/μl 200 μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus） 1.25 ml×2

dNTPs（各2.5 mM） 1 ml×2

6×Loading Buffer 1 ml

注： 10×Pfu Buffer分为Mg²⁺ Plus与Mg²⁺ Free两种包装，可方便选择。如没特别说明提供10×Pfu Buffer(Mg²⁺ Plus)。Mg²⁺ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl₂。

 

保存条件

-20℃保存2年。多次冻融不影响生物学活性。

 

产品说明

Pfu DNA Polymerase是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段

的长度可达2 kb（简单模板）。延伸速度为0.2-0.4 kb/ min（70~75℃）。该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。扩增产物具有平末端。

 

产品特点

• 保真性最高：保真性是Taq DNA聚合酶的10倍。
• 热稳定性好：95℃处理2小时后，酶活性为未经处理酶的95%。
• PCR产物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。

 

产品用途

• 高保真性PCR扩增
• 制备基因克隆或蛋白表达用的PCR产物
• 平末端PCR克隆
• 位点特异性突变

 

活性定义

一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

 

质量控制

相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因；室温放置一周，

扩增活性无明显改变。

 

应用举例

注：以下反应举例为50 μl标准PCR体系，仅供参考。实际PCR条件应根据模板、引物结构、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。

 

以λ DNA为模板，扩增1kb片段。

λ DNA（2.5 ng/μl）　　　　　　　　 1 μl

引物1（10 μM） 　　　　　　　　　 2 μl

引物2 （10 μM）　　　　　　　　　 2 μl

10×Pfu Buffer 　　　　　               　 5 μl

dNTPs（2.5 mM）                              4 μl

Pfu DNA Polymerase（5 U/μl）          1 μl

超纯水 　　　　　 　　         补足至50 μl

 

PCR反应条件

95℃ 3 min

95℃ 30 sec

55~68℃ 30 sec 30 Cycles

72℃ 2 min

72℃ 7 min

 

 

注意事项

1 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端，可直接用于平末端连接。

2 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。

3 建议在冰上配置PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增，得到良好的PCR结果。

4 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10^-6。

5 模板DNA推荐用量（50 μl PCR反应体系）

人类基因组DNA 0.1 – 1 μg

λDNA 0.5 – 5 ng

质粒DNA 0.1 – 10 ng

大肠杆菌DNA 10 – 100 ng

 

Q&A

问：Pfu DNA聚合酶的保真性为何高于Taq DNA聚合酶？

答：这是由于Pfu DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，可在扩增的过程中，切掉错配的碱基，降低碱基错配率。Taq DNA聚合酶的碱基错误率为1×10^-5，而Pfu

DNA聚合酶的碱基错误率仅为1×10^-6。Pfu DNA聚合酶主要用于基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等对保真性有很高要求的实验。其扩增产物只具有

平末端，可直接用于平末端连接。要提高TA克隆效率，建议对PCR产物纯化后，加A再进行TA克隆，加A方法见**页。

 

问：Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段？

答：对于简单模板，可以扩增2 kb以下的片段。扩增长片段时，能否扩增成功主要与模板与引物的设计有关。为获得良好的扩增结果，建议引物长度大于18 bp，

Tm在55-80℃之间，浓度在0.1-0.5μM之间，略高于Taq。如需要很高的保真性，且又扩增较长片段时，建议选择Fusion pfu DNA聚合酶。

 

问：Pfu DNA聚合酶的扩增效率为何低于Taq DNA聚合酶？

答：这可能决定于Pfu DNA聚合酶本身的结构与特性。且具有核酸外切酶的活性，容易降解PCR引物。建议在配制PCR反应时，最后加入Pfu DNA聚合酶或使用

PfuMix。

 

问：使用Pfu DNA聚合酶扩增时，有没有必要在冰上配制PCR反应液？

答：有必要。建议在冰上配制PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性条带背景，获得良好的PCR结果。