肠道沙门氏菌LAMP试剂盒

库存 ：大量

英文名 ：Salmonella enterica

保质期 ：一年

供应商 ：上海钰博生物科技有限公司

保存条件 ：低温运输，-20℃保存

规格 ：50次

产品及特点:
本产品是根据本公司的双染料 LAMP 专利技术开发的专门检测肠道沙门氏
菌荧光和可见光 LAMP 检测试剂盒，它既可以用于荧光 LAMP 扩增及检测，也
可以用于可视化 LAMP 扩增及检测，适用于对肠道沙门氏菌的快速核酸定性检
测。本产品具有下列特点：
1. 可扩增肠道沙门氏菌，避免任何一个发生突变导致漏检。
2. 优化的反应体系。对 20μL 的反应体系，最大样品加样量可达 14 μL。
3. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，
也可用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测，还可以金属浴扩增，qPCR 进行终点荧光读数。
4. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
5. 引物经过精心设计，假阳性率低。
6. 灵敏性可达 1000 拷贝/反应。
7. 本产品跟钰博生物的多种提取试剂盒兼容。
8. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
9. 本产品既可用于 RT-LAMP 扩增及检测，也可用于 LAMP 扩增及检测。
10. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的 LAMP 扩增反应。
规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	4×荧光及可视化 LAMP MagicMix	250 μL（绿盖）
试剂二	20×肠道沙门氏菌LAMP引物混合液	50 μL（白盖）
试剂三	肠道沙门氏菌LAMP阳性对照（1×10E3拷贝/μL）	150 μL（黄盖）
试剂四	超纯水	1 mL（亮黄盖）
	使用手册	1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。
自备试剂： LAMP 模板及 LAMP 引物、PCR 级石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在 60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和 70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。

• 样品 DNA 的制备 

1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 DNA 提取操作，得到 N+2 个 DNA 样品。
二、荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）
3. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP阴性对照和 LAMP 阳性对照各1个。在 N+4个 0.2mL PCR管中加入下列成分：

成分	N+2个样品管	LAMP阴性对照	LAMP阳性对照
4×荧光及可视化LAMP MagicMix	各 5μL	5μL	5μL
20×肠道沙门氏菌LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
N+2 个样品 DNA	各 14μL	--	--
超纯水		14μL	13μL
肠道沙门氏菌 RT-LAMP 阳性对照（1×10E3 拷贝/μL）	--	--	1μL

4. 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三种方式进行扩增和检测。
5. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中加30μL自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率（如果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油）。63℃保温 90 分钟，肉眼观察管内液体颜色。
6. 如果使用荧光定量 PCR 仪：设为 63℃保温 1 分钟/循环， 90 个循环，每分钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。
7. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法荧光读数：则在扩增前和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数（温度设为 63℃，1 次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集一次荧光信号。
注意：测荧光读数必须在 63℃进行）。扩增反应按 63℃ 90 分钟进行。
三、结果分析及解读
8. 如果是用普通 PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结果。将反应管放置在白色背景（如白纸）前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色，则说明试剂有问题，实验无效。请跟厂家联系。
9. 如果实验有效，则分析 N+2 个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。反应结果示例见下图（9 为阴性，10 为阳性）。

10. 如果是用荧光 PCR 仪进行扩增，则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒提供的阳性对照的 Ct 将小于 65，如果大于 65，说明试剂可能失效，需跟厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 90。如果任何小于 90，则说明试剂或环境被污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照 Ct 都在正常范围，则分析样品的 Ct。Ct 小于 65 的判断为阳性，大于 90 判为阴性，在 65-90 之间则需要重复检测。
11. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量PCR 仪进行终点法荧光读数来判断阴阳性，则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品扩增后信号增幅应该超过 100%，阴性对照扩增后信号增幅应该低于 50%，否则实验无效，请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增前后荧光读数的差值。如果扩增后荧光信号增幅低于
50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高于 100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在 50-100%之间的，则需要重测。
12. 当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不一致，以实时荧光 LAMP 的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20-30 分钟，也就是说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其反应液的颜色变化一般在第 50-60 分钟时才能观察到。