分枝杆菌属通用LAMP试剂盒

库存 ：大量

英文名 ：Mycobacterium spp. Fluorescent and Colorimetric LAMP Kit

保质期 ：一年

供应商 ：上海钰博生物科技有限公司

保存条件 ：低温运输，-20℃保存

规格 ：50次

产品及特点:
分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）是一类细长略弯曲的，有时有分枝或出现丝状体。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌。该菌属无鞭毛、无芽胞、不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，对人致病的主要有结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。因此快速灵敏检测分枝杆菌具有重要意义本公司开发了基于环介导等温扩增（LAMP）的产品，专门用于检测分枝杆菌属。
它具有下列特点：
1. 对 20 μL 的反应体系，最大样品加样量达到 14 μL。
2. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
3. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
4. 特异性比 PCR 高，因为 LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。
5. 假阴性率低。
6. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
7. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
8. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的 LAMP 扩增和检测反应。

规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	4×荧光及可视化 LAMP MagicMix	250 μL（绿盖）
试剂二	20×分枝杆菌属通用LAMP引物混合液	50 μL（白盖）
试剂三	分枝杆菌属通用LAMP阳性对照（1×10E3拷贝/μL）	150 μL（黄盖）
试剂四	超纯水	1 mL（亮黄盖）
	使用手册	1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。
自备试剂： 待测样品。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在 60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和 70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。

• 样品 DNA 的制备 

1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 DNA 提取操作，得到 N+2 个 DNA 样品。
二、荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）
3. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP阴性对照和 LAMP 阳性对照各1个。在 N+4个 0.2mL PCR管中加入下列成分：

成分	N+2个样品管	LAMP阴性对照	LAMP阳性对照
4×荧光及可视化LAMP MagicMix	各 5μL	5μL	5μL
20×分枝杆菌属通用LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
N+2 个样品 DNA	各 14μL	--	--
超纯水		14μL	4μL
试剂盒提供的阳性对照（1×10E3 拷贝/μL）	--	--	10μL

4. 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三种方式进行扩增和检测。
5. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中加30μL自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率（如果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油）。63℃保温 90 分钟，肉眼观察管内液体颜色。
6. 如果使用荧光定量 PCR 仪：设为 63℃保温 1 分钟/循环， 90 个循环，每分钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。
7. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法荧光读数：则在扩增前和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数（温度设为 63℃，1 次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集一次荧光信号。
注意：测荧光读数必须在 63℃进行）。扩增反应按 63℃ 90 分钟进行。
三、结果分析及解读
8. 如果是用普通 PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结果。将反应管放置在白色背景（如白纸）前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色，则说明试剂有问题，实验无效。请跟厂家联系。
9. 如果实验有效，则分析 N+2 个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。反应结果示例见下图（9 为阴性，10 为阳性）。

10. 如果是用荧光 PCR 仪进行扩增，则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒提供的阳性对照的 Ct 将小于 65，如果大于 65，说明试剂可能失效，需跟厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 90。如果任何小于 90，则说明试剂或环境被污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照 Ct 都在正常范围，则分析样品的 Ct。Ct 小于 65 的判断为阳性，大于 90 判为阴性，在 65-90 之间则需要重复检测。
11. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量PCR 仪进行终点法荧光读数来判断阴阳性，则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品扩增后信号增幅应该超过 100%，阴性对照扩增后信号增幅应该低于 50%，否则实验无效，请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增前后荧光读数的差值。如果扩增后荧光信号增幅低于
50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高于 100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在 50-100%之间的，则需要重测。
12. 当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不一致，以实时荧光 LAMP 的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20-30 分钟，也就是说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其反应液的颜色变化一般在第 50-60 分钟时才能观察到。