人乳头瘤病毒通用染料法荧光定量PCR试剂盒

库存 ：大量

英文名 ：Human Papillomavirus (HPV) SYBR qPCR Kit

保质期 ：一年

供应商 ：上海钰博生物科技有限公司

保存条件 ： -20℃保存

规格 ：50次

产品及特点
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤
空泡病毒 A 属，属于 DNA 病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，表现为寻常疣、
生殖器疣（尖锐湿疣）等症状。随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门
癌等的增多，人乳头瘤病毒感染越来越引起人们的关注。人乳头瘤病毒有很 130 多种
型，人乳头瘤病毒通用的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司
开发了简单快捷的人乳头瘤病毒通用染料法荧光定量 PCR 检测试剂盒，它具有下列特
点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据人乳头瘤病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应，但能涵盖
40 种人乳头瘤病毒，包括所有高危型和可致病的低危型。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

编号	成分	规格
试剂一	2×qPCR MagicMix	500 μL（棕色管）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	人乳头瘤病毒通用PCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	人乳头瘤病毒通用PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂五	天净沙核酸释放剂试用装	20 次（1mL，绿盖）
	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。 
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万 不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对 照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求 的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品， 则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本 试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout，
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个 样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则 反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	PCR阳性对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix （棕色管）	10μL	10 μL	各 10 μL
人乳头瘤病毒通用PCR引物混合液（白盖）	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 待测样品 cDNA 模板	6 μL	-	-
自备超纯水	-	6	-
第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液（2-7 号）	-	-	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。 

过程	温度	时间
预变性	94℃	3 分钟
PCR 反应 （40 个循环）	94℃	45 秒
	55℃	45 秒（FAM 通道采集信号）
	72℃	60 秒

四、数据处理
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵
轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的
log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等
于 33。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于
30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 33 则为阴性，如果小于或等于 30 则为
阳性。若 Ct 值小于 33，而熔解曲线峰值在 77 左右，可判断为阴性，熔解曲线峰
值在 80 左右，可判断为阳性。