人乳头瘤病毒18 染料法荧光定量PCR试剂盒

库存 ：大量

英文名 ：Human Papillomavirus 18(HPV-18) SYBR qPCR Kit

保质期 ：一年

供应商 ：上海钰博生物科技有限公司

保存条件 ： -20℃保存

规格 ：50次

产品及特点
人乳头瘤病毒是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒 A 属，是球形 DNA 病 毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。表现为寻常疣、生殖器疣（尖锐湿疣）等 症状。 随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，人乳头瘤 病毒（hpv）感染越来越引起人们的关注。其中黏膜高危型 HPV-16、18、30、31、 33、35、39 与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等相关，其早期检测非常重要。 本公司开发人乳头瘤病毒 18 染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 引物根据人乳头瘤病毒 18 专一区设计，特异性高。
3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

编号	成分	规格
试剂一	2×qPCR MagicMix	500 μL（棕色管）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	人乳头瘤病毒18 染料法 qPCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	人乳头瘤病毒18 染料法 qPCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。 
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万 不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对 照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求 的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品， 则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本 试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout，
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个 样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则 反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	PCR阳性对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10μL	10 μL	各 10 μL
人乳头瘤病毒18 染料法 qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 待测样品 cDNA 模板	6 μL	-	-
自备超纯水	-	6	-
第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液（2-7 号）	-	-	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。 

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR 反应 （40 个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min，（采集 SYBR 通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵
轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的
log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等
于 36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于
30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 36 则为阴性，如果小于或等于 30 则为
阳性。如果在 30-36 之间，可结合熔解曲线判断，若样品的熔解温度与阳性对照
相同，该样本判断为阳性，否则为阴性。