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文献和实验
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库存 :大量
英文名 :Novel Bunyavirus SYBR qRT-PCR Kit
保质期 :一年
供应商 :上海钰博生物科技有限公司
保存条件 : -20℃保存
规格 :50次
新型布尼亚病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒Novel Bunyavirus SYBR qRT-PCR Kit
低温运输,-20℃保存
产品及特点:
新型布尼亚病毒,卫生部门从蜱虫中毒者体内分离出的病毒。或将被认定为一 种新型病毒。从目前来看,这一病毒主要由蜱传播,且可以治疗,病死率很低。目 前未发现人传染人的病例。布尼亚病毒自然感染见于许多脊椎动物和节肢动物(蚊、 蜱、白蛉等),可感染小鼠,并能在一些哺乳类、鸟类和蚊细胞培养中生长;对人可 引起类似流感或登革热的疾病、出血热(立夫特谷热和克里米亚─刚果出血热等)及 脑炎(加利福尼亚脑炎)。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒 3 种传播类型。本产品是基于染料 法荧光定量 PCR 原理开发,专门检测新型布尼亚病毒的试剂盒。它具有下列特点:
1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2. 根据新型布尼亚病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达
到至少 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中
间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。
规格及成分:
成分 | 编号 | 小纸盒包装 |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 试剂一 | 500 μL(棕色管) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 试剂二 | 100 μL(红盖) |
ROX 染料 I,50× |
试剂三 | 20 μL(棕色管) |
ROX 染料 II,50× | 试剂四 | 20 μL(棕色管) |
荧光 PCR 专用模板稀释液 | 试剂五 | 1mL(黄盖) |
新型布尼亚病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液 | 试剂六 | 100 μL(白盖) |
新型布尼亚病毒染料法 qRT-PCR阳性对照(1×10E8拷贝/μL) | 试剂七 | 50 μL(黄盖) |
使用手册 | 一份 |
运输及保存:低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 RNA 片段作为阳性对照。
自备试剂:样品 RNA。
使用方法:一、稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
5. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 10 万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
三、设置 RT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):
成分 | N+2 个制备 所得样品 |
RT-PCR 阴性对照 |
RT-PCR 阳性 对照(2-7 管) |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各 10μL |
新型布尼亚病毒染料法 qRT-PCR引物混合液 | 2μL | 2μL | 各 2μL |
50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各 0.4μL |
样品制备所得 RNA 模板(来于第 8 步) | 5.6μL | - | - |
稀释所得 6 个阳性对照 (来于第 6 步) |
- | - | 各 5.6μL(2 号样到 2 号管, 3 号样到 3 号管…) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用 ROX 染料I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。不需要使用 ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
- 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
PT(逆转录) | 50℃ | 30 min |
预变性 | 95℃ | 10 min |
qPCR反应(40个循环) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集SYBR通道的荧光信号) | |
按仪器预设程序进行熔解曲线分析 |
10. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于 或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等 于 32 则为阳性。如果在 32-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。
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