【单细胞】10x Genomics单细胞测序

提供商 ：生物芯片

服务名称 ：单细胞测序

       单细胞测序技术在2013年被 Nature Methods 评为年度技术，被Science评为年度六大生物类科研热点的首位，又在2015年登上Science转化医学封面。 Nature Methods 将2019年年度技术又给了单细胞多组学。2013年以来基于单细胞测序技术获得了多方面的研究进展，文献发表也呈现迅猛增长趋势。即使来源相同的单个细胞，由于随机生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存在差异，即异质性。尤其是肿瘤细胞、免疫细胞、胚胎发育期细胞、干细胞等最为突出。常规的组学技术发现不了这一现象带来的影响，由此研究人员开启了单细胞测序技术的探索之路。

Pubmed收录“single-cell sequencing”文献统计

技术原理：

       单细胞转录组测序利用GemCode™技术的微流控技术进行单个细胞分选，将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录把凝胶珠的特异性barcode引入到cDNA并用于区分细胞；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，结合illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而达到在单细胞水平进行表达测序的目的。10x GenomicsﾠChromium Single Cell单细胞测序技术的发展，极大地促进了单细胞组学研究。

实验流程：

技术特点：
● 真正意义上的单细胞检测（每一个细胞形成单独的GEM，分别进行细胞标记）；
● 超低的单个细胞价格；
● 多细胞捕获率低；
● 超高的捕获效率（单个细胞捕获效率高达65%）；
● 全自动真正单细胞分离、实验周期短；
● 超高的细胞通量（每个样本最多可测10000个细胞，HT每个样本可检测高达20000个细胞）；
● 细胞类型多样化（适宜40μm直径以内，无下限）；
● 通量高（可同时进行8通道检测，HT可同时进行16通道检测）。

产品分类：

● 单细胞转录组
   单细胞转录组测序能够对异质群体中的细胞亚群进行全面的研究，追踪单个细胞的表达谱，鉴定稀有细胞类型，有效地解决组织样本无法破解的细胞异质性难题。
● 单细胞基因表达Flex
   单细胞基因表达Flex以非常高的灵活性带来了超高灵敏度的全转录组分析，样本在固定的同时锁定生物学状态，这样可以保存脆弱样本，并且样本可以大规模、长时间、稳定的运输。此产品有独特的探针设计，探针杂交的同时可以进行样本标记，实现多样本的混样，在一定程度上降低了成本。样本在固定后可进行长期储存。在样本类型上，此产品可兼容FFPE样本。
● 单细胞免疫组库
   单细胞免疫组库测序解决了TCR/BCR双链匹配的问题，可以在单细胞水平完美匹配TCR/BCR双链。
● 单细胞转录组、免疫组库+表面蛋白
   单细胞转录组或免疫组库能够对细胞内转录组及免疫组库进行分析，巧妙利用 Feature Barcode技术及Biolegend配套抗体，同时检测表面蛋白表达变化。
● 单细胞ATAC-seq
   在单细胞层面利用改造后活性极高的转座酶切割开放染色质区域，对此区域进行测序，是转录调控机制研究领域的一种高效、简便的方法。
● 单细胞ATAC+转录组测序
   整合单细胞ATAC测序和转录组测序技术，可以同时在一个细胞内研究基因表达和染色质开放性。

样品要求：
● 细胞总量：细胞总数大于5×10⁵个
● 样品浓度：7×10⁵-1.2×10⁶cells/mL
● 细胞活率：大于80%
● 细胞成团率：小于5%
● 细胞大小：小于40μm
● 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca²⁺和Mg²⁺等影响酶活性的物质
● 组织需解离成单细胞悬液，植物细胞需制成原生质体

应用领域：

数据结果展示：

 

应用案例（一）

CD36+癌相关成纤维细胞通过分泌巨噬细胞迁移抑制因子为肝细胞癌提供免疫抑制微环境
影响因子：38.079
发表时间：2023.03
发表期刊：Cell Discovery
原文：CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellularcarcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor

 

       肝细胞癌(HCC)是一种具有高度细胞异质性的免疫治疗耐药恶性肿瘤。细胞类型的多样性以及肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的相互作用仍有待阐明。人类和小鼠HCC肿瘤的单细胞RNA测序显示癌症相关成纤维细胞(CAF)的异质性。跨物种分析发现CD36+ﾠCAFs表现出高水平的脂质代谢和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)表达。此外，CD36在CD36+ﾠCAFs中通过脂质过氧化/p38/CEBPs轴介导氧化性LDL摄取依赖的MIF表达，CD36+ﾠCAFs以MIF和CD74依赖的方式招募CD33+ﾠ髓源性抑制细胞(MDSCs)。CD36+ﾠCAFs与HCC细胞共植入促进HCC在体内的进展。最后，CD36抑制剂与抗PD-1免疫治疗协同作用，通过恢复HCC中的抗肿瘤T细胞反应。研究者的工作强调了阐明特定CAF亚群功能在理解肿瘤微环境和免疫系统之间相互作用的重要性。
 

应用案例（二）
单细胞免疫组库测序揭示新冠感染和接种疫苗后BCR的变化
影响因子：19.568
发表时间：2022.12
发表期刊：Emerging Microbes & Infections
原文：Comparative global B cell receptor repertoire difference induced by SARS-CoV-2 infection

       为了研究SARS-CoV-2感染和接种灭活疫苗的健康/感染康复者之间BCR的动态差异，研究者对接种过3针灭活疫苗的健康人、接种灭活疫苗的康复患者、未接种过疫苗的康复患者进行单细胞转录组+BCR测序，然后与4名感染患者的B细胞公开数据进行整合分析，发现BCR的V基因使用率在感染组（无论是否已康复）比疫苗接种组更显著。感染后VH基因扩增最多的是IGHV3-33，而接种组中扩增最多的是IGHV3-23。感染组的BCR克隆性扩增和体细胞超突变均高于健康接种组，感染患者、接种疫苗的健康人和康复人群共享一小部分公共克隆型。此外，还鉴定了几种针对SARS-CoV-2刺突蛋白的公共抗体。这些结果全面表征了从 SARS-CoV-2 感染到疫苗接种的BCR重链和轻链配对库，为下一代精准疫苗的开发提供了进一步的指导。
研究背景：
       在SARS-CoV-2感染或疫苗接种后，B细胞会产生抗体，在获得性免疫中起重要作用。在前人研究中，新冠感染或疫苗接种后V基因及免疫球蛋白特征已进行过很多研究，但轻重链的配对关系缺失。因此，本文利用单细胞免疫组库测序方法对不同人群进行分析，从单细胞水平确认BCR的特征。
样品分组：
       1.接种过3针灭活疫苗（BBIBP-CorV）的健康人6例（接种前后均进行检测）；
       2.接种过1针BBIBP-CorV的康复患者5例；
       3.未接种过BBIBP-CorV的康复患者5例；
       4.SARS-CoV-2感染患者4例。