HEPENGBIO真菌/酵母总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂盒

库存 ：20次

保质期 ：6个月

供应商 ：赫澎生物

保存条件 ：-20℃

规格 ：20次

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂质分子的酯键（ester bond）的水解。脂肪酶具有高温和有机溶剂环境下稳定，高度对映有择（enantioselectivity），蛋白水解抗性。尤其是细胞外脂肪酶具有帮助微生物粘附在细胞或组织上，协同其它酶类作用，启动炎症反应以及自我防御等功能。基于脂肪酶在水分子的参与下，催化三丁酸二巯基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，产生二巯基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并释放出巯基基团（－SH），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反应系统为：
 
产品内容

HEPENGBIO裂解液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO强化液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO底色液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO补充液（Reagent F）     微升
产品说明书     1份

保存方式

保存HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO底色液（Reagent E）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
微型台式离心机：用于样品制备
恒温水槽：用于孵育反应
比色皿或96孔板：用于反应和比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
 
实验步骤
 

• 样品准备

 

1. 1. 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升）
   2. 移入到预冷的15毫升锥形离心管
   3. 置于冰槽里5分钟
   4. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
   5. 小心抽去上清液
   6. 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混匀
   7. 转移到预冷的1.5毫升离心管
   8. 加入xx微升HEPENGBIO强化液（Reagent B）
   9. 强力涡旋震荡15秒
   10. 置于冰槽里1分钟
   11. 重复实验步骤9至10五次
   12. 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混匀
   13. 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
   14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
   15. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO BCA蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30031.1）
   16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

• 测定准备

 

1. 准备好待测样品，置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔10分钟，读数4次（共30分钟），并置零 
3. HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
 

1. 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升HEPENGBIO底色液（Reagent E）
3. 上下倾倒数次，混匀
4. 在37℃温度下孵育3分钟
5. 加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
6. 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7. 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）

 

• • • 样品测定

 

1. 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3. 加入xx微升HEPENGBIO底色液（Reagent E）
4. 上下倾倒数次，混匀
5. 在37℃温度下孵育3分钟
6. 加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7. 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）

 

• • • 计算样品活性

  

六、酶标仪测定
 

1. 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2. 分别移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到所有孔里
3. 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）到样品孔里
4. 加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）到背景对照孔里
5. 分别加入xx微升HEPENGBIO底色液（Reagent E）到所有孔里
6. 轻轻摇动96孔板
7. 在37℃温度下孵育3分钟
8. 分别加入10微升待测样品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈，且pH为7.2）
9. 轻轻摇动96孔板
10. 即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和30分钟读数