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计数是细胞培养过程中不可或缺的重要步骤之一。

是什么阻碍了你成为细胞计数大神？

1. 工作量大，精力不够——计数样品太多，数起来没完没了
2. 数学渣——数也数不清，好不容易数完也算不清
3. 手残党——调焦调光差强人意，同一样品多次计数时结果误差大
4. 不想做——还没开始细胞实验，已经对计数过程瑟瑟发抖

而这这对细胞培养过程中的环境条件的控制、细胞生长状态的监控，有着至关重要的表征意义。
 

---- 准备工作 ----

• 血细胞计数板预处理：
  用酒精清洗并擦拭盖玻片，并让酒精自然挥发干透

• 细胞悬液的准备：

  悬浮细胞可直接通过取样，离心，重悬后，直接获取细胞悬浮液。贴壁细胞可使用胰蛋白酶进行消化后离心、重悬。

  轻轻用移液枪吹打细胞悬液3-5次至细胞均匀分布在液体中。

  立刻吸取10-20 µL的细胞悬液样品至新的微量离心管中，并按照1:1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染液，混匀后，静置1-2分钟。 

 

• 加样计数
  轻轻吹打染色后的细胞样品，吸取10-12 µL加至血细胞计数板凹槽处，利用毛细现象使样品均匀铺开。
  
  在显微镜下对准计数板样品区域，用10倍物镜聚焦至计数板的网格线上。
  
  视野中，活细胞会拒染台盼蓝，呈现透亮的光泽，边缘轮廓清晰，死细胞则被台盼蓝染色，呈现出不透明的蓝色。对计数板四角的四个大格中的细胞进行计数（需要测定细胞活力时，活细胞、死细胞需分开单独计数）。对于压住四周边缘线的细胞，仅将其中2条线作为压线细胞可计入计数的范围（如仅计算左边和顶部两条线的压线细胞）。
  
  移动计数板，至视野内出现移至下一组16个角格的大格进行计数，直到所有4组16个角格全部计数完毕。

---- 样品中细胞浓度的计算----

 

• 计算过程：
  假设四个角方格计数分别为A、B、C、D
  四组16个角方格计数出的细胞总数为 (A+B+C+D)
  取每组16个角方格的平均细胞数即 (A+B+C+D)/4
  则计数样品中的细胞浓度为 (A+B+C+D)/4 x 10 ⁴个/mL
  血细胞计数板每个大方块可以容纳的体积为：
  1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 cm3 = 10-4 ml
  即每个大方块的体积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需要乘以10 ⁴
  则加入台盼蓝之前的细胞原液的浓度为上述浓度的2倍 (A+B+C+D)/2 x 10 ⁴个/mL
  
  假设上述计数过程中四个角方格中的活细胞数目为E，死细胞数目为F
  细胞活力（活细胞比例）=E/(E+F) x 100%

• 应用举例: 
  如果16个方格的细胞计数分别为51、42、47、55，则平均细胞计数为:最终数值为原细胞悬液中活细胞数/mL。
  (51 + 42 + 47 +55) ÷ 4 = 48.75
  48.75 x 10 ⁴= 4.875 x 10 ⁵
  4.875x 10 ⁵x 2 = 9.75] x10 ⁵个/mL （在细胞原液中）

 

•  血细胞计数板为玻璃材质，在使用前后需小心处理、轻拿轻放，避免摔碎。
•  台盼蓝染料内往往会存在一些不溶的杂质，干扰计数结果。因而，在染色前对台盼蓝染料进行离心，吸取上清使用有利于减少杂质引起的计数误差。
•  台盼蓝染料有一定的细胞毒性和致癌性，确保染色后的细胞在10分钟以内完成计数，并且避免皮肤直接接触。
•  加样至计数板凹槽时，确保细胞悬液均一地在盖玻片和计数板之间铺平，如有细胞在计数区域产生，会影响计数结果的准确性。
•  计数图像的清晰度对计数结果的准确度有较大的影响。计数前请务必确保调整相机的焦距至激光蚀刻线清晰可见，此时活细胞中部有明显的光泽、轮廓清晰。
•  四个大格内的细胞总数控制在100-200个之间时，计数的准确度更好，细胞浓度过低或者过高都会影响计数结果。聚团细胞按一个细胞计算，但若视野中出现的聚团细胞较多，需考虑样品制备时消化过程是否处理不当。
•  为了减少单次计数的误差，可对一个样品进行多次计数取平均值。