原代间充干细胞无血清培养体系

库存 ：100

细胞类型 ：贴壁生长

物种来源 ：详见说明书

免疫类型 ：详见说明书

细胞形态 ：成纤维细胞

运输方式 ：电询

年限 ：详见说明书

生长状态 ：详见说明书

规格 ：500ml

原代间充干细胞无血清培养体系保存：4℃保存一年，-20℃长期保存
用途：可用于科研实验培养某一类型细胞没有固定的培养条件。

培养操作
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识 3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

注意事项：
1. 收到细胞后先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们，信息确认后我们为您再免费寄送一次。
4. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。
5. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和公司技术部沟通交流。
6. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
实验步骤：
1. 将解剖用的剪刀、镊子和刀片进行无菌消毒。
2. 将怀孕小鼠用颈椎脱位法处死，将其固定在解剖板上。
3. 用70％乙醇喷洒在小鼠的腹部进行消毒，用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
4. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 mLPBS的50 mL离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS，将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其切碎至可用微量移液器吸取。
5. 用200μL的微量移液器反复快速吹打平皿中的液体，放在15 mL离心管中，
4℃ 1500 r／min离心5 min，倒掉上清液，加10 mL胰蛋白酶，重悬沉淀，37℃水浴中消化30 min，且每隔5 min轻轻晃动，使之充分消化。
6. 将上层细胞悬液倒入一装有10 mL DMEM培养基的50 mL离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1 500 r／min离心5 min，弃去上清液。
7. 用移液管吸取30 mL DMEM培养基，让培养液沿离心管壁缓缓流入管底，1 500 r／min离心5 min，弃掉上清液。重复一次此步骤。8. 将细胞沉淀用15 mL培养基悬起。细胞计数(8只14天胎鼠可获得(2～3)×107个细胞)。
9. 将3×106个细胞悬浮于15 mL含10％小牛血清的DMEM培养基中，接种到200 mL的培养瓶中。
10. 24 h后更换新鲜的含10％小牛血清的DMEM培养基。
11. 细胞长满后，弃掉培养基，用PBS小心冲洗，倒掉，加胰蛋白酶消化。
12. 轻轻晃动细胞培养瓶，见有细胞浮起，立即加入2 mL血清终止消化，用移液管把细胞轻轻悬起，混匀，使细胞成为单细胞悬液。
13. 1500 r／min离心5 min。弃掉上清液。加入10 mL含小牛血清的DMEM培养基，悬起细胞，按1：5传代。
14. 细胞再次长到覆盖率80％～90％，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。
15. 实验结果：可拍照存留。