猪瘟病毒野生株RT-LAMP试剂盒

保存条件 ：低温冷藏

保质期 ：详见说明书

英文名 ：RT-LAMP kit for wild strain of classical swine fever virus

库存 ：100

供应商 ：上海莼试

规格 ：50T

猪瘟病毒野生株RT-LAMP试剂盒储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法 1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

eEF1A1    翻译延伸因子EF-1a抗体
Phospho-Estrogen Receptor alpha (Tyr537)     磷酸化雌激素受体α抗体
phospho-EGFR (Tyr1068)    磷酸化表皮生长因子受体抗体
phospho-Erk1 (Thr202 + Tyr204)     磷酸化丝裂原活化蛋白激酶1抗体
phospho-ERK1 (Thr202/Tyr204) + ERK2 (Thr183/Tyr185)    磷酸化丝裂原活化蛋白激酶1/2抗体
EPHB4    酪氨酸蛋白激酶受体B4抗体
Ephrin A5    酪氨酸蛋白激酶A5受体抗体
epithelial Sodium Channel gamma    上皮钠离子通道蛋白γ/γENaC抗体
ETS2    癌基因ETS2抗体
Endothelin 3    内皮素3抗体
phospho-ERK5 (Ser496)    磷酸化细胞外信号调节激酶5抗体
phospho-ERK5 ( Ser731+Thr733)    磷酸化细胞外信号调节激酶5抗体
ERK4    细胞外信号调节激酶4抗体
E.coli O157:H7    肠出血性大肠杆菌埃希氏菌O157:H7抗体
phospho-ERK1 (Thr202+Tyr204) + ERK2 (Thr185+Tyr187)    磷酸化丝裂原活化蛋白激酶ERK抗体
EMR2    CD312抗体
eIF4EBP1    eIF4E结合蛋白抗体
Phospho-EGFR (Ser1045)    磷酸化表皮生长因子受体抗体
Phospho-EGFR (Tyr1138)    磷酸化表皮生长因子受体抗体
Ephrin A1 Receptor    肝配蛋白A1受体抗体
eIF2C2    真核翻译起始因子2C2抗体
EYA2    眼睛发育缺失蛋白EYA2抗体
EYA4    EYA4蛋白抗体
ELK4    血清反应因子辅助蛋白1抗体
ELMO2    吞噬细胞运动蛋白2抗体
EPB41    红细胞膜条带4.1蛋白抗体
phospho-EPO Receptor (Tyr485)    磷酸化红细胞生成素受体抗体
猪瘟病毒野生株RT-LAMP试剂盒E2F7    转录调节因子E2F7抗体
EAAT4    胶质细胞谷氨酸运载蛋白4抗体
EBP1    erbB3结合蛋白1抗体
ECH1    烯酰辅酶A水合酶1抗体
ECHDC2    烯酰辅酶A水合酶含结构域蛋白2抗体
EDAR    肿瘤坏死因子受体超家族成员EDAR抗体
EDC4    自身抗原EDC4抗体
UBR5    E3泛素蛋白连接酶EDD抗体
EED    胚胎外胚层发育蛋白EED抗体
KAT3B/Ep300    转录接头蛋白EP300抗体
Endothelial lipase    内皮脂肪酶抗体
ENO1    MYC启动子结合蛋白1抗体
ERp29    内质网蛋白29抗体
ECHS1    烯脂酰辅酶A水解酶抗体
phospho-eIF4EBP1 (Ser64)    磷酸化4E结合蛋白1抗体
EHHADH    三羟酰辅酶A脱氢酶抗体
EML4    限制过度增殖相关蛋白EML4抗体
ETS1 associated protein II    ETS1相关蛋白2抗体
EFHA1    EFHA1蛋白抗体
phospho-E2F1 (Ser364)    磷酸化转录因子E2F-1抗体
EFHC1    EFHC1蛋白抗体
EFHC2    EFHC2蛋白抗体
EFHD1    EFHD1蛋白抗体
EF-CBP2    突触结合蛋白2抗体
ENPP2    核苷酸焦磷酸酶2抗体
ECHS1    长链烯脂酰辅酶A水化酶抗体
r70)    磷酸化eIF4E结合蛋白抗体

使用方法:
一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（*用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

具有如下优点：
　　(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
　　(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
　　(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
　　(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度在300 bp以内 gt;500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。
　　二、LAMP（20μL 体系）
　　3. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP 阴性对照和阴性对照各 1 个。在 N+4 个 PCR 管中加入下列成分：
　　4. 混匀，此时反应液呈现非常浅的蓝色，由于是否有反应是跟阴性对照和反应前对比，所以一定要设置阴性对照，并且反应前要手机照相留存以供反应后比对。
　　5. 置于 25℃5min（让 UNG 灭活可能的 LAMP 的污染），然后放 61℃扩增60min。如果是在 PCR 仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴保温，没有热盖，必须在孔中加水以填充孔和管子间的空隙，并且在管中加 50μL石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率。
　　6. 80℃10min 灭活 Bst DNA 聚合酶和 UNG 酶。 　　7. 将反应管放置在白色背景前观察，观察反应液颜色并用手机照相留底。
　　8. 实验结果分析。阳性对照将呈现蓝色，无模板的阴性对照将呈现无色或非常浅的蓝色，样品管的颜色如果接近阳性对照则说明有扩增，如果接近阴性对照则说明无扩增。标准的反应结果如下图（9 号为阴性，10 号为阳性，此处的 9 号和 10 号跟下步的电泳照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品）：如果需要也可以电泳确认实验结果：取 10μL LAMP 扩增产物直接进行 2%琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加 loading buffer），使用 100 bpDNA Marker。如果样品为阳性，将会得到梯形扩增产物。典型的电泳结果见下图（奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果。此处的 9 号和 10 号跟上步照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品）。