乙型肝炎病毒E型探针法荧光定量PCR试剂盒

库存 ：大量

英文名 ：Hepatitis B Virus(HBV)

保质期 ：一年

供应商 ：上海康朗生物科技有限公司

保存条件 ：负20度

规格 ：50次

乙型肝炎病毒E型探针法荧光定量PCR试剂盒
Hepatitis B Virus(HBV)
产品及特点
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据非洲猪瘟病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
本产品只能用于科研。

规格及成分

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	0.5 mL（本色盖）
试剂二	荧光PCR专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	乙型肝炎病毒E型PCR引物	100 μL（白盖）
试剂四	乙型肝炎病毒E型qPCR探针	100 μL（棕色管）
试剂五	乙型肝炎病毒E型阳性对照2.0 (1×10E8拷贝/μL)	50 μL（红盖）
试剂六	核酸释释剂试用装	50次（2.5mL）
	使用手册	1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂：样品DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送50次免DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成份	N+2 个 样品管	PCR 阴性 对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
乙型肝炎病毒E型qPCR探针	2μL	2μL	各2μL
乙型肝炎病毒E型 PCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
待测样品DNA模板	6μL	不加	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

 11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR 反应 （40 个循环）	94℃	0.5 min
	55℃	0.5 min（采集FAM通道的荧光信号）
	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	10 min

• 数据处理
  12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
  13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
  
  荧光定量试剂对低丰度基因进行扩增定量时，较易出现无信号或者非特异性扩增，且Ct值常大于30。通过加大样本量或反应体系，亦无显著改观。其中一个重要的原因是目的基因浓度较低时，Taq酶不能有效结合到目的扩增区域，导致扩增失败。
  荧光定量PCR试剂多年研发经验的基础上研发而成的定量试剂，该产品采用了抗体法热启动Taq酶。抗体与Taq酶紧密结合，在50℃反应30min条件下，仍然可以封闭95%以上的酶活，有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域，限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增。同时，配方添加了提升PCR反应扩增效率的因子，大大提升扩增效率，保证定量结果的可靠性，非常适合低浓度模板的扩增。
  3.产品特点
  ★灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
  ★特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
  ★稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
  ★扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！