产品详情
文献和实验
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库存 :大量
英文名 :Hepatitis B Virus(HBV)
保质期 :一年
供应商 :上海康朗生物科技有限公司
保存条件 :负20度
规格 :50次
乙型肝炎病毒C型探针法荧光定量PCR试剂盒Hepatitis B Virus(HBV)
产品及特点
1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化,灵敏性高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据非洲猪瘟病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
本产品只能用于科研。
规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×Probe qPCR MagicMix | 0.5 mL(本色盖) |
试剂二 | 荧光PCR专用模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 | 乙型肝炎病毒C型PCR引物 | 100 μL(白盖) |
试剂四 | 乙型肝炎病毒C型qPCR探针 | 100 μL(棕色管) |
试剂五 | 乙型肝炎病毒C型阳性对照2.0 (1×10E8拷贝/μL) |
50 μL(红盖) |
试剂六 | 核酸释释剂试用装 | 50次(2.5mL) |
使用手册 | 1 份 |
自备试剂:样品DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品,最好设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送50次免DNA提取的核酸释放剂试用装,该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板,省略了DNA提取步骤。
三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
9.如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线样品。
10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
成份 | N+2 个 样品管 |
PCR 阴性 对照管 |
标准曲线 样品管(2-7管) |
2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
乙型肝炎病毒C型qPCR探针 | 2μL | 2μL | 各2μL |
乙型肝炎病毒C型 PCR引物混合液 |
2μL | 2μL | 各2μL |
待测样品DNA模板 | 6μL | 不加 | 不加 |
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) | 不加 | 不加 | 各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5 min |
PCR 反应 (40 个循环) |
94℃ | 0.5 min |
55℃ | 0.5 min(采集FAM通道的荧光信号) | |
72℃ | 0.5 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
- 数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
13.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。
荧光定量试剂对低丰度基因进行扩增定量时,较易出现无信号或者非特异性扩增,且Ct值常大于30。通过加大样本量或反应体系,亦无显著改观。其中一个重要的原因是目的基因浓度较低时,Taq酶不能有效结合到目的扩增区域,导致扩增失败。
荧光定量PCR试剂多年研发经验的基础上研发而成的定量试剂,该产品采用了抗体法热启动Taq酶。抗体与Taq酶紧密结合,在50℃反应30min条件下,仍然可以封闭95%以上的酶活,有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域,限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增。同时,配方添加了提升PCR反应扩增效率的因子,大大提升扩增效率,保证定量结果的可靠性,非常适合低浓度模板的扩增。
3.产品特点
★灵敏度高:可检测个位拷贝数的基因
★特异性高:有效避免非特异性扩增的出现
★稳定性高:复孔间差异小,实验结果重复性强
★扩增性能优:扩增效率高,荧光信号强
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
上海康朗生物科技有限公司
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