Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit / 55℃反应，获得15 kb cDNA，用于qPCR仅需15 min，含DNase/反转录系列试剂/擎科生物TSINGKE
价格： ￥525 - 1500
产品详情
文献和实验
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保存条件 ： -25~-15℃保存，有效期1年。
英文名 ：Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit
库存 ：充足
供应商 ：北京擎科生物科技股份有限公司
规格 ：30次/100次
Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit
50℃反应，获得15 kb cDNA，用于qPCR仅需15 min
【产品简介】
本产品是专为两步法RT-PCR第一步cDNA第一链合成开发的试剂盒，它包含以RNA为模板合成cDNA所需的所有试剂。
产品中的Goldenstar® RT6逆转录酶由改造的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLVRT）经体外大肠杆菌重组表达而来。野生型M-MIV RT在分子生物实验中有两个明显的缺点∶（1）带有RNase H活性。它会降解RNA模板及中断cDNA链的合成;（2）热稳定性差。RNA以各种复杂的多级结构存在，提高逆转录反应的温度，破坏其复杂结构的稳定性有利于逆转录的顺利进行，但同时也使酶的活性大大降低。GoldenstarTM RT6逆转录酶解决了上述两个问题。通过删除M-MLVRT的RNase H活性，能有效减少RNA模板的降解，使其聚合酶活性和持续性大大增强;其后通过随机突变筛选出热稳定性强的逆转录突变体，使其反应温度提高至50℃，有利于含复杂结构RNA的逆转录进行。
产品中的Goldenstar® RT6逆转录酶由改造的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLVRT）经体外大肠杆菌重组表达而来。野生型M-MIV RT在分子生物实验中有两个明显的缺点∶（1）带有RNase H活性。它会降解RNA模板及中断cDNA链的合成;（2）热稳定性差。RNA以各种复杂的多级结构存在，提高逆转录反应的温度，破坏其复杂结构的稳定性有利于逆转录的顺利进行，但同时也使酶的活性大大降低。GoldenstarTM RT6逆转录酶解决了上述两个问题。通过删除M-MLVRT的RNase H活性，能有效减少RNA模板的降解，使其聚合酶活性和持续性大大增强;其后通过随机突变筛选出热稳定性强的逆转录突变体，使其反应温度提高至50℃，有利于含复杂结构RNA的逆转录进行。
【产品特点】
RNase H活性缺失，产量高，产物长；
热稳定性强，有利于含复杂结构RNA的逆转录进行。
【产品应用】
本产品合成的第一链cDNA可广泛用于第二链cDNA合成、PCR扩增、杂交、cDNA文库制作、全长cDNA合成等。
【产品组成及保存】
-25~-15℃保存，有效期一年。
| 组分 | 规格 | |
| TSK301S(30 次 ) | TSK301M(100 次 ) | |
| Goldenstar® RT6 (200 U/µL) | 30 µL | 100 µL |
| 5×Goldenstar® Buffer | 150 µL | 500 µL |
| DTT(0.2 M) | 40 µL | 120 µL |
| dNTP Mix(10 mM) | 40 µL | 120 µL |
| Goldenstar® Oligo(dT)17(50 μM) | 40 µL | 120 µL |
| Goldenstar® Randomer(50 μM) | 40 µL | 120 µL |
| RNase-free Water | 1 mL | 1 mL |
【注意事项】
1.实验中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染。操作人员需佩戴口罩和一次性手套，实验中经常更换手套，使用RNase-free耗材。
2.为保证逆转录成功，请使用高质量的RNA。推荐使用琼脂糖凝胶电泳的方法检测RNA完整度。
3.本产品中各组分在冰上解冻后，应充分混匀并短暂离心后使用。
5.逆转录酶的一个活性单位被定义为：使用Poly(A)为模板，Oligo(dT)物，在37℃反应10 min，将1 nmol的dTTP转化为产物所需的酶量。
【操作流程】
1. 在无核酸酶的微量离心管中按如下表格配置逆转录反应体系，轻轻混匀后瞬时离心；
| 组分 | 使用量 |
| 5×Goldensta® Buffer | 4 µL |
| dNTP Mix | 1 µL |
| Goldenstar® Oligo(dT)17 or Randomer* | 1 µL |
| DTT | 1 µL |
| Goldenstar® RT6 | 1 µL |
| RNA Template** | ** |
| RNase-free water | Up to 20 µL |
| 组分 | 使用量 |
*产物用于cDNA全长扩增，则使用Oligo(dT)17；产物用于qPCR，则使用Randomer。
**总RNA 10 ng~5µg；mRNA 0.5 ng~0.5µg。
2. 反转录程序
如果用Goldenstar® Oligo(dT)17或GSP：50℃ 30-50 min，85℃ 5 min
如果用Goldenstar® Randomer：25℃ 10 min，50℃ 30~50 min或15 min（产物用于qPCR），85℃ 5 min
如果要获得更高的反转录效率，逆转录温度可提高至55℃，也可优化反应过程，详见说明书。
【问题讨论】
Q1：一步法or两步法逆转录？如何选择？
A1：根据自身实验需求进行选择，擎科生物Goldenstar® RT6系列逆转录试剂盒，用于两步法RT-PCR第一步cDNA第一链合成。
2. 反转录程序
如果用Goldenstar® Oligo(dT)17或GSP：50℃ 30-50 min，85℃ 5 min
如果用Goldenstar® Randomer：25℃ 10 min，50℃ 30~50 min或15 min（产物用于qPCR），85℃ 5 min
如果要获得更高的反转录效率，逆转录温度可提高至55℃，也可优化反应过程，详见说明书。
【问题讨论】
Q1：一步法or两步法逆转录？如何选择？
A1：根据自身实验需求进行选择，擎科生物Goldenstar® RT6系列逆转录试剂盒，用于两步法RT-PCR第一步cDNA第一链合成。
| 逆转录方法 | 优势 | 劣势 |
一步法 |
1. 消除了样品转移步骤，不仅消除了控制物污染的潜在来源，且需较少的准备和操作时间
2. 使用的引物是基因特异性引物，灵敏度高，常用于分析低表达水平基因。
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1. 同一样本中只有有限数量的目的基因被扩增，且需在转录和扩增间寻找一个平衡； 2. 逆转录与扩增同时进行，易产生交叉影响； 3. 模板不易保存，每次实验需重新提取RNA。 |
两步法 |
1. 可将大批量RNA转化为cDNA，然后储存后用于后续实验，检测大量基因；
2. 可使oligo(dT)或随机引物合成第一链cDNA，逆转出所有mRNA信息；
3. 在优化RT和PCR步骤后，可更好地控制实验过程；
4. 只有少量的转录本用于PCR，则从RNA分离到RT反应的抑制剂（乙醇、酚及胍盐等）被稀释降低抑制 |
1. 更耗费时间，且带来污染的可能性更高；
2. RT过程及条件需以相同效率逆转录RNA，否则会影响qPCR的启动效率，带来不同的实验结果。
|
Q2：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A2：不可以。逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。
Q3： 用Goldenstar® Randomer引物逆转录时，反应程序25℃ 10 min的作用是什么？
A3： 为了结合更多的模板RNA。
【实例分享】
1. Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit卓越的反转录效率
实验目的：扩增小鼠HDAC6基因CDS区上三段不同大小的目标序列，1.5 kb，2.5 kb，4.8 kb。
实验设计：分别以国内A公司、进口B公司及擎科RT6逆转录试剂盒反转后的cDNA为模板，用本公司金牌Mix（cat.TSE101）及三对引物分别扩增。
扩增电泳检测结果如下：
2.使用Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit逆转录小鼠RNA得到cDNA，稀释。针对小鼠MOCT4基因设计Real-time Quantification PCR引物，使用本公司2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）试剂盒（cat.TSE202）和其他两家公司对比进行qPCR反应。
本试剂产品仅供科学研究或进一步生产使用,不可用于临床诊断或治疗。
北京擎科生物科技股份有限公司
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