Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2/55℃反应，获得15 kb cDNA，用于qPCR仅需15 min，含DNase/反转录系列试剂/擎科生物TSINGKE
价格： ￥675 - 1800
产品详情
文献和实验
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保存条件 ：-25~-15℃保存，有效期1年
英文名 ：Goldenstar®RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2
库存 ：充足
供应商 ：北京擎科生物科技股份有限公司
规格 ：30次/100次
Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2
55℃反应，获得15 kb cDNA，用于qPCR仅需15 min，含DNase
【产品简介】
本产品是专为两步法RT-PCR第一步cDNA第一链合成开发的试剂盒，它包含以RNA为模板合成cDNA所需的所有试剂。
产品中的Goldenstar® RT6逆转录酶由改造的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLVRT）经体外大肠杆菌重组表达而来。野生型M-MLVRT在分子生物实验中有两个明显的缺点∶（1）带有RNase H活性。它会降解RNA模板及中断cDNA链的合成;（2）热稳定性差。RNA以各种复杂的多级结构存在，提高逆转录反应的温度，破坏其复杂结构的稳定性有利于逆转录的顺利进行，但同时也使酶的活性大大降低。Goldenstar® RT6逆转录酶解决了上述两个问题。通过删除M-MLVRT的RNase H活性，能有效减少RNA模板的降解，使其聚合酶活性和持续性大大增强;其后通过随机突变筛选出热稳定性强的逆转录突变体，使其反应温度提高至55℃，有利干含复杂结构RNA的逆转录进行。
本产品提供的gDNA Remover可彻底去除RNA模板中残留的基因组DNA，qPCR结果更加可靠，并可简化qPCR引物设计，无需跨内含子设计引物。
【产品特点】
RNaseH活性缺失：产量高、产物长；
热稳定性强，有利于复杂结构RNA逆转录的进行；
快速去除基因组污染。
【产品应用】
本产品合成的第一链cDNA可广泛用于第二链cDNA合成、PCR扩增、杂交、cDNA文库制作、全长cDNA合成等。
【产品组成及保存】
-25~-15℃保存，有效期一年。
本产品是专为两步法RT-PCR第一步cDNA第一链合成开发的试剂盒，它包含以RNA为模板合成cDNA所需的所有试剂。
产品中的Goldenstar® RT6逆转录酶由改造的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLVRT）经体外大肠杆菌重组表达而来。野生型M-MLVRT在分子生物实验中有两个明显的缺点∶（1）带有RNase H活性。它会降解RNA模板及中断cDNA链的合成;（2）热稳定性差。RNA以各种复杂的多级结构存在，提高逆转录反应的温度，破坏其复杂结构的稳定性有利于逆转录的顺利进行，但同时也使酶的活性大大降低。Goldenstar® RT6逆转录酶解决了上述两个问题。通过删除M-MLVRT的RNase H活性，能有效减少RNA模板的降解，使其聚合酶活性和持续性大大增强;其后通过随机突变筛选出热稳定性强的逆转录突变体，使其反应温度提高至55℃，有利干含复杂结构RNA的逆转录进行。
本产品提供的gDNA Remover可彻底去除RNA模板中残留的基因组DNA，qPCR结果更加可靠，并可简化qPCR引物设计，无需跨内含子设计引物。
【产品特点】
RNaseH活性缺失：产量高、产物长；
热稳定性强，有利于复杂结构RNA逆转录的进行；
快速去除基因组污染。
【产品应用】
本产品合成的第一链cDNA可广泛用于第二链cDNA合成、PCR扩增、杂交、cDNA文库制作、全长cDNA合成等。
【产品组成及保存】
-25~-15℃保存，有效期一年。
| 组分 | 规格 | |
| TSK302S(100 次 ) | TSK302M(100 次 ) | |
| Goldenstar® RT6 (200U/µL) | 30 µL | 100 µL |
| 5×Goldenstar® Buffer | 150 µL | 500 µL |
| DTT(0.2 M) | 40 µL | 120 µL |
| dNTP Mix(10 mM) | 40 µL | 120 µL |
| gDNA remover | 40 µL | 120 µL |
| 10×gDNA remover Buffer | 40 µL | 120 µL |
| Goldenstar® Oligo(dT)17(50 μM) | 40 µL | 120 µL |
| Goldenstar® Randomer(50 μM) | 40 µL | 120 µL |
| RNase-free Water | 1 mL | 1 mL |
【注意事项】
1.实验中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染。操作人员需佩戴口罩和一次性手套，实验中经常更换手套，使用RNase-free耗材。
2.为保证逆转录成功，请使用高质量的RNA。推荐使用琼脂糖凝胶电泳的方法检测RNA完整度。
3.本产品中各组分在冰上解冻后，应充分混匀并短暂离心后使用。
5.逆转录酶的一个活性单位被定义为：使用Poly(A)为模板，Oligo(dT)物，在37℃反应10 min，将1 nmol的dTTP转化为产物所需的酶量。
【操作流程】
1. 去除基因组
在无核酸酶的微量离心管中按如下表格配置反应体系，轻轻混匀后瞬时离心：
| 组分 | 用量 |
| RNA template | * |
| gDNA remover | 1 µL |
| 10×gDNA remover Buffer | 1 µL |
| RNase-free Water | UP to 10 µL |
42℃ 2 min，60℃ 5 min，立即置于冰上冷却，短暂离心
*总RNA 10 ng~5µg；mRNA 0.5 ng~0.5µg。
2.继续加入如下逆转录试剂
*总RNA 10 ng~5µg；mRNA 0.5 ng~0.5µg。
2.继续加入如下逆转录试剂
| 组分 | 组分 |
| dNTP Mix(10 mM) | 1 µL |
| Goldenstar® Oligo(dT)17(50 μM)or Randomer* | 1 µL |
| 5×Goldenstar® Buffer | 4 µL |
| DTT(0.2M) | 1 µL |
| Goldenstar® RT6 (200U/µL) | 1 µL |
| RNase-free Water | 2 µL |
*产物用于cDNA全长扩增，则使用Oligo(dT)17；产物用于qPCR，则使用Randomer。
3.反转录程序
如果用Goldenstar® Oligo(dT)17或GSP：55℃30~50 min，85℃ 5 min
如果用Goldenstar® Randomer：25℃10 min，55℃30~50 min或15 min（产物用于qPCR），85℃ 5 min
【问题讨论】
Q1：逆转录后，产物产量低或质量不佳？
A1：
1）RNA模板用量过低。建议提高模板用量至说明书建议范围；
2）RNA模板具有复杂二级结构。建议采用更高反应温度的产品（TSK302）及推荐的复杂模板反应程序；
3）逆转录引物选择不佳。根据建议选择合适的逆转录引物；
4）RNA模板中含有反应抑制物。建议对模板进行去抑制物处理或稀释后逆转；
5）RNA模板降解。建议对RNA模板进行检测，使用质量好的模板，保证在无核酸酶的操作环境里进行逆转录实验，避免外界RNA酶污染；
6）RNA模板存在污染。建议对RNA模板进行检测，使用质量好的模板；
7）逆转录体系、程序及加样等操作不当。建议按照说明书规范操作。
Q2：擎科逆转录系列适用于microRNA逆转录吗？
A2：可以。但仅适用于茎环法，针对目的microRNA序列设计特异性的茎环引物和qPCR引物，逆转时使用茎环引物和内参引物即可。（详细实验方案可咨询当地技术支持）
Q3：逆转录试剂盒中DTT出现了沉淀，还能继续使用吗？
A3：不可以，必须更换DTT。DTT全名为二硫苏糖醇，还原剂。常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可以阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子在内或分子间二硫键。
【实例分享】
使用Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2逆转录小鼠RNA得到cDNA，稀释。
针对小鼠MOCT4基因设计Real-time Quantification PCR引物，使用本公司2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）试剂盒（TSE202）进行qPCR反应。
3.反转录程序
如果用Goldenstar® Oligo(dT)17或GSP：55℃30~50 min，85℃ 5 min
如果用Goldenstar® Randomer：25℃10 min，55℃30~50 min或15 min（产物用于qPCR），85℃ 5 min
【问题讨论】
Q1：逆转录后，产物产量低或质量不佳？
A1：
1）RNA模板用量过低。建议提高模板用量至说明书建议范围；
2）RNA模板具有复杂二级结构。建议采用更高反应温度的产品（TSK302）及推荐的复杂模板反应程序；
3）逆转录引物选择不佳。根据建议选择合适的逆转录引物；
4）RNA模板中含有反应抑制物。建议对模板进行去抑制物处理或稀释后逆转；
5）RNA模板降解。建议对RNA模板进行检测，使用质量好的模板，保证在无核酸酶的操作环境里进行逆转录实验，避免外界RNA酶污染；
6）RNA模板存在污染。建议对RNA模板进行检测，使用质量好的模板；
7）逆转录体系、程序及加样等操作不当。建议按照说明书规范操作。
Q2：擎科逆转录系列适用于microRNA逆转录吗？
A2：可以。但仅适用于茎环法，针对目的microRNA序列设计特异性的茎环引物和qPCR引物，逆转时使用茎环引物和内参引物即可。（详细实验方案可咨询当地技术支持）
Q3：逆转录试剂盒中DTT出现了沉淀，还能继续使用吗？
A3：不可以，必须更换DTT。DTT全名为二硫苏糖醇，还原剂。常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可以阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子在内或分子间二硫键。
【实例分享】
使用Goldenstar® RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2逆转录小鼠RNA得到cDNA，稀释。
针对小鼠MOCT4基因设计Real-time Quantification PCR引物，使用本公司2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）试剂盒（TSE202）进行qPCR反应。
本试剂产品仅供科学研究或进一步生产使用,不可用于临床诊断或治疗。
北京擎科生物科技股份有限公司
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