2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）/快速耐脏型探针法专用试剂/荧光定量系列/擎科生物TSINGKE价格

保存条件：-25~-15℃避光保存，避免反复冻融。

英文名：2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）

库存：充足

供应商：北京擎科生物科技股份有限公司

规格：5×1.0 mL

2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）
快速耐脏型探针法专用qPCR试剂

【产品特点】
抗体修饰的热启动酶，灵敏度高、特异性强、稳定性好；
特别优化的反应缓冲液，重复性好，可信度高；
配有适合不同机型的ROX Reference Dye。

【产品简介】
本产品是采用探针法进行Real Time PCR的专用试剂，可对目的片段进行快速、高特异性的定量检测。产品中包含经抗体修饰的热启动DNA聚合酶及特别优化的反应缓冲液系统，显著提高了扩增的特异性和灵敏度，可在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确地定量与检测。配套的ROX Reference Dye I/II可用于校正仪器孔间误差。本产品为浓度2×的预混液，使用时只需添加模板、引物、探针和ddH₂O，使Mix工作浓度为1×即可。

【产品组成及保存】
-25~-15℃避光保存，避免反复冻融。

组分	规格
2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）	5×1 mL
50×ROX Reference Dye I（High）	200 µL
50×ROX Reference Dye II（Low）	200 µL

【操作流程】
1.在PCR管中配制如下反应液，混匀短暂离心后，上机反应。

	20 µL
2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）	10 µL
10 µM Primer F	0.8 µL
10 µM Primer R	0.8 µL
10 µM Probe*	*
50×ROX Reference Dye I/II**	0.4 µL
Template DNA/cDNA	***
ddH₂O	Up to 20 µL

*反应中探针引物终浓度0.2 μM 即可得到较好的扩增效果，也可以根据实际情况在0.2~1 μM之间进行调整。
**根据不同仪器类型选择ROX
**如果模板为DNA，建议用量不超过100 ng，如果模板为cDNA，建议用量不超过总反应体系的1/10，根据稀释梯度结果确定用量。

2.推荐如下qPCR反应程序 (两步法)

		温度	时间	循环次数	采集荧光
1	预变性	95 ℃	2~5 min*	1 cycle	/
2	循环反应	95 ℃	10 s	40 cycles	/
2	循环反应	60 ℃	20-50 s**	40 cycles	采集

*如果模板为cDNA，反应2 min，模板为DNA反应5 min。
**使用两种或以上的探针，反应时间可以增加至50 s。

【问题讨论】
Q1：使用探针法进行荧光定量，该如何选择探针？
A1：选择报告荧光基团时首先要确认激发波长和发射波长与仪器匹配。对于多重荧光反应，标记不同探针的报告基团染料的最大发射波长应该至少有15 nm的差异。
对于淬灭荧光基团，必须保证其吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。
尽量不要选择TAMRA作为淬灭基团。因为TAMRA本身就是个荧光基团，虽然它也有淬灭作用，但也会加强本底荧光强度。

淬灭基团种类以及使用的报告基团种类的选择
淬灭基团种类				淬灭基团性质		使用的报告基团种类
TAMRA				荧光物质		AM、HEX、TET、JOE 等
BHQ 系列染料		BHQ1		非荧光物质		AM、HEX、TET、JOE 等
		BHQ2		非荧光物质		Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5 等
		BHQ3		非荧光物质		Cy5 等
荧光基团与淬灭基团的适配建议
荧光基团	最大激发波长		最大发射波长	可选择的淬灭基团
				BHQ1	BHQ2		BHQ3	DABCYL	TAMRA
				480-580(535)	550-650(579)		620-730(672)	380-550(453)	470-560(544)
FAM	494 nm		荧光物质	✓				✓
TET	521 nm		非荧光物质	✓				✓	✓
JOE	520 nm		非荧光物质	✓				✓	✓
HEX	535 nm		非荧光物质	✓				✓	✓
VIC	538 nm			✓				✓	✓
CY3	552 nm				✓			✓	✓
TAMRA	560 nm				✓
ROX	587 nm				✓
CY5	649 nm				✓		✓

Q2：如何设计一条好的探针？
A2：
长度和位置：探针长度通常在20-30 bp，确保达到好的猝灭效果。探针5’应尽可能靠近上游引物3'，但不要重叠，以确保Taq DNA聚合酶快速切割降解。
序列：避免连续的单碱基重复序列，尤其是G，这可能会影响探针的二级结构，并降低杂交效率。特别是探针的5'端的第一个碱基不能为G，它能淬灭荧光。比如即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。探针内部或探针与两条引物之间避免3个碱基以上的互补序列。
熔解温度：Taqman探针的Tm要比引物Tm高约10℃，通常在65~70℃，以确保探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板结合的稳定程度，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。新型Taqman MGB探针通过在探针上共轭一个MGB基团可以使探针Tm提高10℃，使得探针长度只需要13~20 bp，其特异性和灵敏性都更高，常用于SNP分型。
保守性：探针序列要求绝对保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不同的碱基最好不要在两端，不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或C。
BLAST检索确认探针特异性。为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在BLAST中核实一次，若发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

Q3：探针法qPCR出现直线型扩增曲线是什么原因？
A3：探针部分降解会导致直线型扩增。一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月，探针的反复冻融会导致降解；探针在光线下暴露时间太长也会引起降解。反应液中有PCR抑制物也会导致直线型扩增。

【实例分享】
完美精准分型
以不同人类基因组gDNA样本为模板，对rs4947963位点进行分型