Western blot检测自噬流

提供商 ：研载生物

服务名称 ：Western blot检测自噬流

一、技术简介 
1. 微管结合蛋白 1A/1B-轻链 3 的检测
目前使用最为广泛的自噬流检测方法是通过Western blot 检测 microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B) 蛋白表达水平，但是如果没有自噬工具药作为对照，则观察到的 LC3B 改变无法真实反映细胞内自噬流状态。例如 LC3B-II 增加既可能是自噬活化后自噬小体增多而成，也可能是自噬溶酶体清除失败所致。自噬流的检测方法较为复杂，单独使用现有的某一种技术方法往往不能达到系统性检测自噬流，因此需要选择多种不同实验方法，综合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流状态。
2. 使用自噬相关工具药物检测 LC3B-I/II 转化
到目前为止伴随使用自噬晚期抑制剂，通过检测LC3B-I/II 转化是自噬流检测的金指标。当使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素 A1 (bafilomycin A1, Baf A1)刺激细胞时，细胞内自噬溶酶体降解被抑制，此时观察到的 LC3B-II 的变化仅代表自噬小体数量的改变。当细胞自噬流活化后，LC3B-II 的含量会在使用 Baf A1的基础上进一步增加，而当细胞自噬流阻断后, LC3B-II 的含量则不会在使用 Baf A1 的基础上发生改变。除 Baf A1 外，其他一些能提高溶酶体 pH 值的自噬晚期抑制剂也可以用于自噬流的检测。若待检测药物+Baf A1 组 LC3B-II 与仅 Baf A1 处理组相比显著增加则代表所检测药物可以增加自噬小体或自噬溶酶体的合成。相反，若处理组与对照组相比，LC3B-II 降低则代表处理药物减少自噬小体的合成。
3. 应用 GFP-LC3B 剪切实验评价自噬流
GFP-LC3B 融合蛋白不仅能够利用其荧光标签进行检测，还可利用溶酶体对标签蛋白的切割通过 Western blot进行检测。GFP-LC3B 蛋白进入到自噬溶酶体内后 LC3B 部分对溶酶体中的蛋白水解酶较为敏感，较容易被降解。而融合蛋白中的 GFP 部分则对于溶酶体中的蛋白水解酶敏感性较低，不容易被降解。使用GFP 抗体进行 Western blot 检测可能会检测到 GFP-LC3B-I、GFP-LC3B-II 和游离 GFP 标签三个条带，若出现游离 GFP 标签条带则代表细胞自噬流活化。此外, 在检测同一细胞样品时还可以使用 LC3B 抗体检测内源性 LC3B-I 向 LC3B-II 转化。值得注意的是游离 GFP 标签的出现仅代表自噬流适度活化，当自噬流过度活化时细胞内自噬溶酶体中的 pH 值进一步降低, 其降解蛋白的能力进一步增强，因此GFP标签蛋白也被逐渐降解消失。由此可见，若观察不到游离GFP 标签，则有可能是由于自噬流阻断，也有可能是由于自噬流过度活化所致。当自噬流过度活化时，若想要观察到 GFP 标签条带则需要配合使用低浓度自噬抑制剂，如氯化铵或氯喹。这些药物能中和溶酶体中的酸性环境，又不完全抑制细胞自噬功能，但当自噬流阻断时即使使用低浓度自噬抑制剂也无法观察到游离 GFP 标签。
4. 自噬标志性蛋白
1）自噬标记蛋白LC3
    微管相关蛋白1轻链3(LC3／Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切，成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰。与自噬体膜表面的磷脂酰 醇胺(PE)偶联，成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜,因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以估计自噬水平的高低。

2）细胞自噬底物蛋白的检测
p62偶联于LC3，作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬的中、晚期被降解。细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。蛋白质免疫印迹技术检测p62水平的降低可以反映自噬活性程度。p62的增加暗示着自噬、溶酶体降解途径被抑制。

3）Atg12-Atg5复合体 
除了LC3，自噬体膜上标志性蛋白质还有Atg12-Atg5结合体。Atg12和Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。

4）Beclin1 
哺乳动物Beclin1是酵母Atg6基因的同源物。Beclin1通过激活自噬对细胞生长和抑瘤机制进行控制。蛋白质印迹技术检测Beclin1蛋白表达情况直接反映自噬活性。

5）自噬相关的标志性蛋白还包括ATG1、ATG9、DRAM1、ATG14、ATG16以及 ATG18等。
5. 自噬的调控通路
1）依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬
A．PI3K-AKT-mTOR信号通路

 B. AMPK-TSC 1/2-mTOR 信号通路
2）其它的信号通路
A. 3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬；
B. beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成ClassⅢPI3 复合物调控自噬；
C. GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬；
D. 死亡相关蛋白激酶（death-associated proteinlinase, DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1, DRP-1）诱导自噬。

二、实验流程
1. 蛋白质抽提。
2. 蛋白质定量。
3. 变性聚bing烯酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE）。
4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜。
5. 膜的封闭和抗体孵育。
6. 结果检测。
7. 提供实验报告。
三、服务说明及结果
1. 客户提供：组织或细胞和一抗，或者一抗代购。
2. 公司提供：基本实验步骤、图片、数据分析结果。
3. 实验周期：10个工作日。如需要我司进行细胞处理，周期适当延长。









【欢迎来电/邮件咨询】
联系人：刘经理
电话：021-54376058
手机：13917998048 (7:00-24:00, 周末节假日不休)
邮箱：yanzaibio@yihaowan.cn, yanzaibio@163.com
官网：www.yihaowan.com.cn
地址： 上海市闵行区放鹤路1088号博济科技园6号楼109室