表达策略/基因表达/Cre/Flp/四环素/Tet-on/Tet-off

表达策略

1.Cre依赖——Cre-Loxp系统
Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是由大肠杆菌噬菌体P1编码的Cre基因编码，343个氨基酸组成的38 kd的蛋白质。Cre不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点。
LoxP（locus of X-overP1）位点长为34 bp，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。
（1）Cre-Loxp系统诱导基因重组的方式
Cre-loxP是一种位点特异的基因重组技术，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位。Cre重组酶识别特异的DNA 序列，即loxP位点，使两个loxP位点间发生基因重组，重组的结果取决于两个loxP位点的方向。

主要存在几下几种重组方式：
①两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列；
②两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；
③两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；
④四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。
（2）Cre-Loxp重组系统的优势
①时空特异性，特定启动子或调控基因；
②高效性，不受靶基因大小和位置的影响；
③准确性，动物模型中未见非特异重组；
④快速性，受精卵分裂前。

2.Flp依赖——Flp-FRT系统
FLP（flippase）也是一种位点特异DNA重组酶，类似于Cre，克隆自酿酒酵母，由423个氨基酸组成。Flp重组酶作用反向重复序列中两个长48 bp的FRT位点，一些FRT突变体也能被Flp识别，包括F3等，通常这些突变体只能与自身相同序列发生重组。
（1）Flp-FRT重组系统诱导基因重组的方式
①当FRT在同一条DNA上且方向相同时，则两FRT位点之间的基因被删除；
②当FRT在同一条DNA上且方向相反时，则两FRT位点之间的基因被倒置；
③当FRT分别位于不同DNA链上时，则会导致两条DNA链上FRT位点间的序列发生易位。

3.四环素诱导系统
四环素（tetracycline, Tet）诱导系统利用Tet及其衍生物对目的基因进行诱导表达，具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点。
Tet系统基本原理是由诱导药物改变调控蛋白的构象，从而控制目标蛋白的表达。Tet阻遏蛋白（Tet repressor protein，TetR）与Tet操纵基因（Tet operator，TetO）DNA序列有特异的亲和能力，当细胞内无Tet存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的抗性基因表达。反之当Tet存在时，药物使TetR得构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。利用这一特性，已发展多种类型的Tet调控系统，根据其表达特点可分为：抑制型系统Tet-off和激活性系统Tet-on。
（1）抑制型系统Tet-off
其反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element，TRE)、最小CMV启动子(minimal CMV promoter，PminCMV)及目的基因组成。
当细胞内无Tet或其衍生物强力霉素(doxcycline, Dox)的存在时，tTA可与TRE结合，打开基因表达；而当Tet或Dox存在时，它们可使tTA中的TetR改变构象，则tTA将从TRE上脱落下来，使TRE中的PminCMV处于非激活状态，从而使基因表达处于关闭状态。
（2）激活性系统Tet-on
Tet-on系统与Tet-off系统的区别在于其调节蛋白质为反义Tet转录活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator，rtTA)。rtTA是由反义TetR(reverse TetR,，rTetR)与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR的表型与TetR相反，在无Dox时其不能结合TRE，导致基因表达关闭；而在有Dox存在时其会结合在TRE上， 导致基因表达开放。
（3）Tet诱导调控表达系统的优点
①具有低本底和高诱导倍数的特点，无诱导时目的基因表达水平低，诱导时其表达水平增高，诱导倍数可达10,000倍；
②可进行精准调节，目的基因的诱导倍数与诱导剂的量及诱导时间存在一定的关系，所以可以完成对基因表达的精确调节；
③特异性高，在哺乳动物中无类似的DNA靶序列，因此不影响宿主基因；
④安全性高且不产生强毒性，Tet作为抗生素已被应用很长时间，且低剂量Tet即可调节基因表达，对人体较为安全；
⑤诱导时间短，加入诱导剂30 min内可检测到目的基因的表达；
⑥具有可逆性，除去诱导剂一定时间后可使该系统关闭，之后可通过加入诱导剂重新开启。

4.活动依赖启动子
①c-fos：即刻早期基因，即细胞受刺激后，在其细胞内迅速表达的基因，通常90min是c-fos蛋白表达的高峰。
②SARE：合成的启动子，增强的突触活动反应元件；SARE（synaptic activity-response elements)。
③PRAM： Robust Activity Marking system promoter

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