无内毒素质粒小提试剂盒说明书价格

英文名：EndoFree Plasmid Mini Kit

保存条件：室温（15-25℃）

无内毒素质粒小提试剂盒说明书
EndoFree Plasmid Mini Kit
无内毒素质粒小提试剂盒

目录号：K2106

运输条件：室温（15-25℃）。

保存条件：室温（15-25℃）。

组分说明

                  Size                    50 preps
                  Buffer P1                 15 ml
                  Buffer P2                 15 ml
                  Buffer E3                 15 ml
                  Buffer PS                 15 ml
                  Buffer PW（concentrate）    10 ml
                  Endo-Free Buffer EB       10 ml
                  RNase A （10 mg/ml）       150 ul
                  Endo-Remover Column        50
                  Spin Column DM             50

             本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途产品简介

　　内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如
果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种简单、快捷、
高效提取无内毒素质粒的新方法，提取的质粒最大限度去除内毒素，并能有效去除基
因组DNA、RNA、蛋白等污染，操作简单方便。
　　本试剂盒通过碱裂解法裂解细胞，新型硅基质膜高效专一的结合质粒DNA，同时采
用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤柱，有效去除内毒素、蛋白等杂质。由本试剂盒所
得质粒纯度高、质量稳定，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，基
于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等下游实验。

试剂盒说明

样本量           得率       洗脱体积         实验时间         提取方式
1-5 ml 菌液     3-40 µg    50-100 µl    1-1.5 小时               柱式

自备试剂：无水乙醇、异丙醇。

实验前准备及重要注意事项

1．所有组分可在干燥、室温（15-25℃）环境稳定保存1年，更长时间保存可置于2-8℃。
   加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。
2．第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1 中，混匀，置于2-8℃保存。
3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。
4．使用前请先检查Buffer P2 和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，
   可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。
5．注意不要直接接触Buffer P2和Buffer E3，使用后应立即盖紧盖子。
6．提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有
   关。
7．所有离心步骤均可在室温下进行。

操作步骤

1．取1-5 ml（根据培养菌体的浓度选择合适的量，建议最多不超过5 ml）过夜培养的菌
   液，加入离心管（自备）中，>6200×g (~8000 rpm) 离心3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。

   注意：质粒拷贝数较低或>10 kb时，可以使用更多菌液通过二次离心将菌体沉淀收集到同一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及E3的量需加倍。所加试剂的量必须能够充分裂解菌体，菌体过多、裂解不充分都会降低质粒的提取效率。
2．向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），
   使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

   注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。
3．向离心管中加入250 μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室
   温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

   注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。
4．向离心管中加入250 μl Buffer E3，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉
   淀，室温放置5分钟。16,200×g（~ 13,000 rpm）离心10分钟，吸取上清，将上清加
   入过滤柱（Endo-Remover Column）中，16,200×g离心1分钟过滤，滤液收集在离
   心管（自备）中。

   注意：Buffer E3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
5．向滤液中加入225 μl异丙醇，上下颠倒混匀。
6．柱平衡：向已装入收集管的吸附柱（Spin Column DM）中加入200 μl Buffer PS，
   16,200×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7．将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱（已装入收集管）中。
8．16,200×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

   注意：吸附柱的最大容积为750 μl，所以第7步中所得溶液分2次过柱。
9．向吸附柱中加入750 μl Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），16,200×g离心
   1分钟，倒掉收集管中的废液。
10.将吸附柱重新放回收集管中，16,200×g离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干
   燥5分钟。

    注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
11.将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100 μl Endo-Free
         Buffer EB，室温放置2-5分钟，16,200×g离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管
         中。-20℃保存质粒。

         注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，16,200×g离心2分钟。Endo-Free Buffer EB在65-70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。

         2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

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                        常规实验操作
普通质粒提取
                       （如   PCR，酶切，测序，转化等）
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