腺相关病毒/慢病毒包装

提供商 ：OBiO和元生物

服务名称 ：腺相关病毒/慢病毒包装服务

腺相关病毒载体介绍：
    腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发受体介导的AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体（Endosome）、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。
慢病毒载体介绍：
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，借助慢病毒载体可以进行基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作，满足不同的基因操作需求，同时慢病毒具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图2）。 慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳定细胞株，用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗，CRISPR/Cas9文库构建使用的也是慢病毒载体。
不同病毒载体特点：
不同病毒的生物学特性比较

	慢病毒	腺相关病毒	腺病毒	逆转录病毒
包膜	有	无	无	有
颗粒直径	90-100 nm	20-30 nm	60-90nm	~100nm
基因组	dsRNA	ssDNA	dsDNA	RNA
表达起始时间	48-72h	72-96h	24-48h	48-72h
表达持续时间	> 2 months	> 6 months	< 1 month	> 2 months
体内扩散能力	一般	强	强	一般
免疫原性	中等	极低	强	中等
滴度范围	108~109TU/mL	1012-1013VG/mL	1011-1012PFU/mL	107~108TU/mL
滴度检测方法	qPCR整合DNA	qPCR非整合DNA	抗原抗体免疫染色试剂盒	qPCR整合DNA
整合方式	随机高频整合	定向低频整合（rAAV不整合）	非整合	随机整合
应用范围	体外细胞感染，gRNA文库筛选，体内	基于不同的血清型，体内广泛应用	嗜肝，快速表达或短期表达，血液、心脏，细胞系等	特异性只感染分裂期的细胞

腺相关病毒载体应用介绍：
1 rAAV血清型选择
目前已注册的AAV种类总数已超过196种，灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身，值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒载体。随着研究的不断深入，研究人员发现不同血清型的AAV之间可以杂交，而杂交后的AAV会兼有杂合双方的特点，因此，AAV亚型顺势诞生。
不同血清型AAV的组织嗜亲性

血清型	组织亲和性
rAAV2/1	神经系统（高滴度顺向跨突触），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌
rAAV2/2	视网膜、神经系统，肌肉，肝脏，血管平滑肌
rAAV2/3	肌肉，肝脏，肺，眼
rAAV2/4	神经系统，肌肉，眼，脑
rAAV2/5	神经系统，肺，视网膜，肝脏，滑膜关节
rAAV2/6	神经系统，肺，肌肉，心脏
rAAV2/7	肌肉，肝脏
rAAV2/8	神经系统，肝脏，肌肉，脂肪组织，胰腺，视网膜，
rAAV2/9	神经系统，心肌，肺，视网膜，皮肤
rAAV2-retro	神经系统（逆向非跨突触）
AAV-P&H&P.eB	跨血脑屏障（静脉注射）
AAV-P&H&P.S	全外周神经（尾静脉注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾静脉注射）
AAV-DJ	视网膜，肺，肾脏，体外感染细胞
AAV-7m8	视网膜
AAV-ShH10Y	视网膜Muller细胞
AAV-Rh10	肝脏，血液，心脏，体外感染细胞
AAV-Anc80L65	内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9	SVZ区神经干细胞

2 rAAV应用案例
2.1 外侧缰核&光遗传学
客户发表文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Keta-mine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相关病毒, 抑郁症, 光遗传]
2.2 臂旁核&化学遗传学
客户发表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]
2.3 丘脑&钙离子成像
客户发表文章：客户发表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]
慢病毒载体应用介绍：
1体外感染细胞
慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。

细胞名	中文名称	慢病毒感染MOI
MGC80-3	人胃癌细胞	10
HT-29	人结肠癌细胞	20
RKO	人结肠腺癌细胞	10
Caki-1	人肾透明细胞癌皮肤转移细胞	10
5637	人膀胱癌细胞	10
U-118 MG	人脑星形胶质母细胞瘤	10
RWPE-1	人正常前列腺上皮细胞	20
HeLa	人宫颈癌细胞	10~20
Ca Ski	人宫颈癌肠转移细胞	10
MCF7 [MCF-7]	人乳腺癌细胞	10
A549	人非小细胞肺癌细胞	10(中科院为40-80）
NCI-H1299	人非小细胞肺癌细胞	20
U-87 MG	人脑星形胶质母细胞瘤	10
U251	人胶质瘤细胞	10
A172	人胶质母细胞瘤细胞	10
K-562	人慢性髓原白血病细胞	10
HL-60	人原髓细胞白血病细胞	10
GES-1	人胃上皮细胞	20
U266	人骨髓瘤细胞	20
CAL 27	人舌鳞癌细胞	20
PC9	人肺癌细胞	5
PC14	人肺癌细胞	10
MADB-106	大鼠乳腺癌细胞	20
F98	大鼠脑胶质瘤细胞	20
MHCC-97H	人肝癌细胞（高转移）	10~20

2 案例介绍（和元客户文章）
2.1慢病毒在肿瘤研究中的应用
常通过构建稳转株，体外进行细胞功能学实验，进一步构建肿瘤模型，验证基因功能。
2.1.1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1 2.1.2 Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒过表达/干扰：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro 2. 2 慢病毒在神经系统的应用（在体注射）
2.2.1 Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆] 病毒类型：慢病毒
载体名称：LV-Suv39h1-RNAi（不确定详细的）
注射部位：海马DG区
病毒注射量：2 μL，9.98 × 108 TU/mL
检测时间：2周

2.2.2 Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路] 病毒类型：慢病毒
载体名称：LV- CX36-shRNA-EGFP（不确定详细的）
注射部位：P1小鼠新皮层L1
病毒注射量：1μL
检测时间：2周
2.2.3 Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症] 病毒类型：慢病毒
载体名称：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位：小鼠海马CA1区
病毒注射量：1μL
检测时间：4周
3 慢病毒延伸服务 咨询服务热线：021-58585887   联系人：姜女士    联系电话：13501676670 联系邮箱：jxl@oobio.com.cn

客户发表文献（部分）：
[1] Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Keta-mine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相关病毒, 抑郁症, 光遗传]
https://www.nature.com/articles/nature25509
[2] Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]
https://science.sciencemag.org/content/362/6413/429.full
[3] Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]
https://science.sciencemag.org/content/357/6352/695.full
[4] Cell. (IF=31.398). Zhu HY,et.al. (2018). Moderate UV Exposure Enhances Learning and Memory by Promoting a Novel Glutamate Biosynthetic Pathway in the Brain. [腺相关病毒, 学习与记忆]
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30507-5
[5] Nature Neuroscience. (IF=19.912). Guo BL,et.al. (2019). Anterior cingulate cortex dysfunction underlies social deficits in Shank3 mutant mice. [腺相关病毒, 社交恐惧，光遗传，化学遗传]
https://www.nature.com/articles/s41593-019-0445-9
[6] Cell. (IF=36.216). Meng Xu,et.al.(2019).LECT2,a Ligand for Tie1,Plays a Crucial Role in Liver Fibrogenesis.[慢病毒, 肝纤维化]
[7] Cell. (IF=36.216). Ta Chung Yu,et.al.(2017).Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy. [腺病毒, 结直肠癌]
[8] Cancer Discovery.(IF=26.37). Sun TT,et.al.(2016).A novel IncRNA GClnc1 promotes gastric carcinogenesis and may act as a modular scaffold of WDR5 and KAT2A complexes to specify the histone modification pattern. [腺病毒, 胃癌, lncRNA]
[9]CellResearch.(IF=17.848).Gong-BoFu,et.al.(2018).Expansion and differentiation of human hepatocyte-derived liver progenitor-like cells and their use for the study of hepatotropic pathogens. [腺病毒，肝细胞系]
[10] Nature cell biology.(IF=17.728). Shao-Ming Shen,et.al.(2019).PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation. [慢病毒，内源激活，结直肠癌]