草鱼呼肠孤病毒毒通用荧光定量RT-PCR试剂盒--探针法

库存 ：20

英文名 ：Grass Carp Reovirus(GCRV)

保质期 ：12个月

供应商 ：上海信裕生物科技有限公司

保存条件 ：-20℃

规格 ：50次

产品名称：草鱼呼肠孤病毒毒通用荧光定量RT-PCR试剂盒--探针法
英文名称：Grass Carp Reovirus(GCRV) RT-PCR Kit
产品规格：50T/盒
探针法原理：
探针的基本原理是利用扩增过程中 Taq 酶的 5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针 5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在 PCR 过程中延伸，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq 酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光，经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。
所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

RT-qPCR是由三个步骤组成: 
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA; 
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物
产品特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据草鱼呼肠孤病毒毒通用高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
5. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	探针法qRT-PCR缓冲液	500μL
试剂二	探针法qRT-PCR酶混合液	100μL
试剂三	荧光PCR专用模板稀释液	1 mL
试剂四	草鱼呼肠孤病毒毒通用探针法qRT-PCR引物混合液	100μL
试剂五	草鱼呼肠孤病毒毒通用qRT-PCR探针	50μL
试剂六	草鱼呼肠孤病毒毒通用探针法qRT-PCR阳性对照(1×10E8拷贝/μL)	50 μL
产品说明书		1份

储存条件：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：样品 RNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 带芯枪头分别加入45μL荧光RT-PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

1. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
2. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

1. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
2. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2 个	RT-PCR 阴性 对照 管	标准曲线 样品管 （2-7 管）
探针法qRT-PCR缓冲液	各10μL	10μL	各10μL
探针法qRT-PCR酶混合液	各2μL	2μL	各2μL
草鱼呼肠孤病毒毒通用qRT-PCR探针	各1μL	1μL	各1μL
草鱼呼肠孤病毒毒通用探针法qRT-PCR引物混合液	各2μL	2μL	各2μL
待测样品RNA模板	各5μL	不加	不加
超纯水	不加	5μL	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各 5 μL（2 号 样到 2 号管， 3 号样到 3 号 管…）

1. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30 min
预变性	94℃	10 min
PCR反应 （40个循环）	94℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）

数据处理

1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
2. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
   特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！