单细胞免疫组库测序

提供商 ：武汉康测科技有限公司

规格 ：具体价格请咨询我们：027-6552 7552

一、产品背景介绍

T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，是人类基因组中多样性最高的区域之一，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。TCR可分为TCR α/β和TCR γ/δ两种类型，外周血T细胞主要为TCR α/β的T细胞。T细胞受体库的多样性保证T细胞在识别和杀伤外源性抗原时更为快速、准确和有效，同时也直接反映了机体免疫应答的状态。

T细胞受体库多样性主要来源于TCR基因中V（D）J基因区域的重排。TCR基因由可变区（V）、多变区（D，只存在于β和δ链中)、结合区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成，形成互补决定区（complementarity determining region，CDR）和间隔的骨架区（framework region，FR）。在T细胞发育过程中CDR1、2和FR区域相对保守，CDR3区具有很高的多样性，直接决定了TCR的抗原结合特异性。CDR3区是由V、D和J进行重排形成的具有功能的TCR区域，由于V、D、J基因片段本身具有多样性，此外在重排过程中，V-D和D-J连接区会发生非模板的核苷酸插入和删除，进一步增加CDR3多样性。因此，CDR3是TCR研究关注的重点。

传统的免疫组库研究技术通常是用多重PCR或RACE扩增和建库TCR CDR3区，再结合高通量测序技术实现，但往往只能检测TCR和BCR一条链的序列信息，也无法进行受体双链的匹配研究。

2015年，10x Genomics发布了基于微流控和油滴包裹技术的Chromium 单细胞系统平台，可实现高通量的单细胞转录组和单细胞V(D)J测序。不但可以将TCR/BCR双链完美匹配，获得TCR/BCR双链组成情况，而且可以细化到单细胞水平，同时获得5’端转录组信息。


二、实验流程

（一）文库制备流程
 

首先，准备含有上百万独特barcode信息的gel beads，结构如下图所示。Barcode序列用于标记和区分不同的细胞，长16nt，同一个gel bead中的barcode序列一致，不同gel beads中barcode序列不一致；UMI用于标记和区分一个细胞中不同的转录本，长10nt，同一个gel bead中UMI各不相同；switch oligo是用于和反转录后cDNA相连的oligo序列，长13nt。

图示：Gel beads结构示意图

然后，gel beads与细胞、酶的混合物混合，然后在位于微流体“双十字”交叉系统中与油表面活性剂溶液结合，形成GEMs（Gel Bead-In-Emulsions）。

图示：GEM形成过程示意图

之后，gel beads溶解释放barcode序列，同时mRNA先是通过ployT引物反转录，在cDNA末端加上与switch oligo反向互补的序列CCC，与switch oligo末端GGG序列互补配对，实现cDNA的捕获，继续转录从而在cDNA序列加上barcode序列。

接下来，用5’接头的通用引物和TCR C区巢式引物进行巢式PCR，此过程加上测序接头P5，实现TCR区域富集。

最后，通过酶切的方式将cDNA随机打断，通过控制打断长度而最终得到可以覆盖整个TCR片段的cDNA序列，末端修复加A，再加上测序接头P7，PCR扩增建库。

得到的文库结构为：

下机数据中read1中存储reads的barcode和UMI信息；read2中是TCR片段的实际序列。

（二）分析流程

根据10x Genomics官方推荐，分析流程大致如下：

1. 首先使用10x Genomics官方提供的CellRanger软件，对同一细胞（barcode）下reads进行UMI过滤，contig拼接和组装；

2. 根据各细胞拼接出的contig序列，进行样本clonotype分型分析、丰度分析及特征分析；

3. 样本间聚类分析及克隆型比较分析。

图示：10x单细胞免疫组库分析流程

 

三、部分结果展示

四、康测科技技术优势总结
 

1.在细胞水平，构建和注释全长V(D)J序列；

2.获得单细胞中TCR的α和β链配对情况；

3.获得单细胞中BCR的重链和轻链配对情况，同时获得重 链isotype类型；

4.可同时获得一个细胞的TCR、BCR和5’基因表达情况

五、应用方向
 

1.允许我们探索更多新的T/B细胞类型和功能；

2.在单细胞水平上，构建样本更为精细的免疫组库；

3.相比传统B细胞抗体筛选，单细胞免疫组库可以加速 抗体筛选；

4.进行单细胞VDJ测试，辅助肿瘤免疫疗法（TCR-T）等开发。