Protein A免疫沉淀磁珠试剂盒

库存 ：44

英文名 ：Protein A Immunoprecipitation Kit

保质期 ：1年

供应商 ：上海莼试

保存条件 ：2～8℃保存

规格 ：20次/100次

参数规格:

产品名称	Protein A免疫沉淀磁珠试剂盒
英文名称	Protein A Immunoprecipitation Kit
货号	CS-X14036

中文名称：Protein A免疫沉淀磁珠试剂盒
英文名称：Protein A Immunoprecipitation Kit
产品规格：20次/100次
发货周期：1～3天
产品简介:
Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及试剂盒系列产品是利用纳米表面技术使Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性微球表面，与当前国际免疫磁珠市场上同类产品相比，该产品具有更多的抗体结合位点，磁珠使用量更少，非特异性结合率低，可便捷高效地进行免疫沉淀实验。每毫升免疫沉淀磁珠结合Human IgG的能力可达到300μg以上，单个沉淀反应仅需25μL磁珠即可完成检测。微米级磁珠提供的超大比表面积，大幅缩短抗体与抗原吸附所需的平衡时间，15 min内即可完成抗体吸附过程，30 min内完成抗原沉淀操作。简短的操作时间避免长时间操作造成目标蛋白水解，保证了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。
免疫沉淀磁珠试剂盒配有经过优化预制的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。
本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。操作者可以参考本操作说明书，附表1的数据了解不同种属来源及亚型的抗体与Protein A磁珠、Protein A/G的结合能力。
储存条件：2～8℃保存
保存期：1年
注：磁珠结合Human IgG能力(Antibody Capacity)分别为：Protein A：0.4～0.5 mg/mL; Protein A/G：0.5～0.6 mg/mL
操作流程：
1. 抗原样品制备：本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。
血清样品处理：若目标蛋白丰度较高，建议用结合缓冲液(②)稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10～100 μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
悬浮细胞样品处理：离心收集细胞(4℃，500 g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 μL的比例用1× PBS(③)洗涤2次；按每毫克细胞5～10 μL的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM 的PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4℃,14000 g,10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每1.0×105个细胞150 μL的比例用1×PBS(③)洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1.0×105个细胞20～30 μL 的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4℃，14000 g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
大肠杆菌样品处理：离心收集大肠杆菌(4℃，12000 g，2 min)，弃上清后称重，按每克(湿重)菌体 10 mL的比例用1×PBS(③)洗涤2次；按每克(湿重)菌体5～10 mL的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM 的PMSF)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，17000 g，10 min)。
2. 磁珠预处理：将免疫沉淀磁珠(①)漩涡振荡1 min，使磁珠充分振荡重悬；取25～50 μL磁珠悬液置 于1.5 mL EP管中。加入200 μL 结合缓冲液(②)洗涤，进行磁性分离［将EP管放置于磁性分离器(⑦)上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；该操作描述以下省略］，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管，重复洗涤一次。最后加入200 μL 结合缓冲液(②)重悬磁珠以备用。
3. 抗体结合反应：
抗体工作液的制备：用结合缓冲液(②)稀释抗体样品，配制成终浓度为5～50 μg/mL抗体工作液，置于冰上备用。
抗体吸附：将步骤2预处理的磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液；加入200 μL抗体工作液，迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管，15 min后进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。
洗涤：向EP管中加入200 μL 结合缓冲液(②)洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管。重复以上洗涤操作一次。
4. 抗体交联反应 (备选)：如操作者需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，进行步骤5。
本步骤适用于操作者需要单独洗脱目标抗原的试验，推荐使用BS3(Thermo Scientific，Cat. #21580)作为交联剂，相关实验请参照该试剂的操作说明。
5. 抗原沉淀反应
抗原吸附：加入200 μL步骤1中制备的抗原样品，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管10 min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1 h或者在4℃下反应过夜。
洗涤与转移：将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200 μL 洗涤缓冲液(④)洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁性分离器上取下EP管，再重复洗涤两次。最后加入 200 μL 洗涤缓冲液(④)，用移液器将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP管中*，并执行磁性分离，移弃上清。
(*注：抗原洗脱前务必将磁珠转移到新的EP管，避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱。)
6. 抗原洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
变性洗脱法：此法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入25 μL 1× SDS-PAGE Loading Buffer(自备)混合均匀，95℃加热5 min。然后执行磁性分离［也可以使用离心的方式(室温下13000 g，10 min)］ 收集上清液进行SDS-PAGE检测。
非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入20 μL 洗脱缓冲液(⑤)混合均匀，室温孵育10 min。然后执行 磁性分离［也可以使用离心的方式(4℃，13000 g，10 min)］，收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 μL中和缓冲液(⑥)将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。
注意事项：
1. 进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读本操作说明书。
2. 本产品须与磁性分离器配套使用。
3. 磁珠使用前应充分振荡均匀。
4. 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥。
5. 请勿将磁珠冷冻或离心，以免引起不可逆聚集。
6. 10×PBS(③)应在无菌条件下稀释，一旦发现溶液有污染情况，请停止使用该溶液。
7. 为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。
8. 操作者可根据实际需求，利用抗体结合反应步骤以及抗原结合反应步骤中收集的上清液检测抗体、抗原和磁珠的结合情况。
9. 对于IP实验，不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到结合缓冲液和洗涤缓冲液的影响，因此，如果操作者使用本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结 果，可自行筛选及配制缓冲液进行实验。
10. 本磁珠表面包被的重组蛋白Protein A/G在极端条件下(如低pH、加热处理)存在极低的蛋白脱落情 况，但仍然不建议操作者用于分子量约130 kD目标蛋白的免疫沉淀实验。
11. 本产品仅供研究使用。

注意事项：
1. 微量试剂取用前请离心集液。
2. Annexin V-PE/7-AAD 避光保存及使用。
3. 7-AAD 为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不推荐用于检测组织样本。
5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，建议适用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。
6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
产品特点：
1.Protein A免疫沉淀磁珠试剂盒 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.使用了优质溶胶液，不含传统溶胶液的碘化钠和高氯酸盐，不抑制回收后酶切、连接克隆等下游反应。
3.独特的溶胶液/结合液配方，将溶胶和结合两种功能统一，因此一个试剂盒可以运用于琼脂糖DNA回收、PCR产物清洁纯化、酶切产物纯化回收等多种情况，节省了需购买多种试剂盒的费用，
4.溶胶液/结合液调制成为了黄颜色，便于观察溶胶效果和监测pH值变化从而达到最佳结合效果，大大提高回收效率。
5.改进的溶胶液配方,大大提高了缓冲能力和稳定性，即使样品变化很大也能将PH缓冲在最佳结合范围内。
6.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
操作步骤：
1. 样品染色
1) 将Binding Buffer（10×）稀释成1×Binding buffer工作液备用（1ml Binding Buffer（10×）需加入9ml无菌去离子水）。
2) 对于悬浮细胞，500-1000g离心5min收集细胞。
对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500-1000g离心5min收集细胞。
3) 收集细胞后，加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。
4) 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×106 cell/ml。
5) 吸取100μl细胞悬液（细胞总数为1×105 cell）至一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。
2. 样品检测
1) 流式细胞仪检测：
染色孵育后，每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液，混匀后使用流式细胞仪检测（1小时内检测）。
建议设置经凋亡诱导的正常细胞、PI单染和Annexin V-FITC单染3个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果可用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FITC为横坐标，PI为纵坐标。Annexin V-FITC和PI联合使用时，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色双重荧光。
2) 荧光显微镜检测：
染色孵育后涂片，显微镜下观察。使用荧光显微镜上的蓝光和绿光通道分别观察FITC和PI。被Annexin V-FITC结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞，细胞核显示红色，膜上有绿色光环。
Cyclohexanone环已25克AR，99.8%
Cyclohexanol六100克GR，99.8%
Cyclo-C盐环胞5克试剂级，99%
cyclic GMP3',5'-环一鸟苷盐500u高，
Cyanuric chloride2,4,6-三-1,3,5-三嗪5克AR，
Curdlan可得然胶1克高，
Curcumin克扣明500克IND
Cuprous oxide化二铜250克AR，97%
Cuprous iodide化亚铜25克CP，99%
Cuprous chloride化低铜1克CP，98.5%
Cuprous bromide一溴化铜25克CP，
Cuprizon新铜试剂500毫升AR，99%
Cupric tartrate trihydrate葡萄铜500克CP，
Cupric sulfide化高铜25克BR，
Cupric subcarbonate盐性铜5克CP，99%0.2mlAnti-Calpain2/FITC荧光素标记钙蛋白酶2抗体IgG111787-200801
0.2mlAnti-Calponin1/FITC荧光素标记钙调节蛋白-1抗体IgG111788-200801
0.2mlAnti-Camk1g/FITC荧光素标记钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶IG抗体IgG111792-200901
0.2mlAnti-CaMK2a/FITC荧光素标记钙/钙调素依赖蛋白激酶2α抗体IgG111793-200901
0.2mlAnti-CaMK2b/FITC荧光素标记钙/钙调素
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