口蹄疫病毒Asia1亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

库存 ：20

英文名 ：Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)

保质期 ：12个月

供应商 ：上海信裕生物科技有限公司

保存条件 ：-20℃

PCR常见问题解决:
1.在出现PCR之前，传统的重组DNA技术是应用限制性内切核酸酶和连接酶通过切割和连接对DNA进行操作。而最通用的方法是T载体克隆。但这个方法有很多缺点，如限制酶的酶切位点有限、浓度不高（需要提很多的T载体）。PCR的出现解决了以上问题。但要把你克隆的片段连到载体上时，一般是通过在引物的两端加上酶切位点。
2.模板变性：就是使你的DNA材料加热时发生变性变成单链。一般的加热温度是92-96度，这要视你DNA的复杂度和反应体积而定。对于用于菌为扩增材料的，一般是要预变性（一般95度5min视菌株而定但变化不会很大），然后才进入循环。
3.引物退火：就是使寡核苷酸引物与和它互补的单链靶序列杂交即引物和模板DNA的复性。这一步的理论是引物以远多于靶序列的数量存在，长度也短于靶序列，因而它们与互补序列的配对速度比靶序列重新配对成双链的速度快几个数量级。在这个过程中采取的温度Ta至关重要，Ta由引物与靶序列的同源性程度和寡核苷酸的碱基（可以用Tm表示）组成决定。Ta过高会使引物不能很好的与模板的复性扩增效率会很低，过低会扩增出的结果会有很多杂带。一般会比Tm低2-5度。Tm下边会专门讲。
4.  扩增效率的问题：lightcycle扩增效率在1.9-2.05之间认为结果是可以应用的，有可比性。其它仪器是90-105%，因为我没用过其它的仪器，有见过这种仪器类型的网友可以补充一下。
5.  realtime pcr的重复性问题：通常相同试剂、相同模版、同一个反映条件CT不要相差一个循环以外。比如复孔。
6.  梯度稀释问题：将模版10倍稀释后，每个梯度CT值相差要控制在3.3-3.5个循环之间。
如果CT值超过30个循环以后，就不适宜做梯度稀释了，因为这个时候浓度太低，定量本来就不准，所以梯度稀释结果不能用作参考的。
7.  标准曲线：通常有些人做很多标本，要用不同的pcr反应板，不能同时一次进行，这时每个反应板最好做标准曲线，斜率相差小于0.1，结果可认为具有可比性。且扩增斜率要在-3.6到-3.1之间结果最好。当然了，这个时候因为每个板都做标准曲线了，分析的时候既可以用detadetaCT法，也可以用双标准曲线法了。
延伸：即寡核苷酸引物的延长。对于Taq DNA聚合酶，这一步通常在72度下进行。在这一温度下，Taq DNA聚合酶的聚合速率约为2000 bp/min。
它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据口蹄疫病毒Asia1亚型保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR MagicMix	A	500μL（棕色管）
荧光 PCR 专用模板稀释液	B	1 mL（黄盖）
口蹄疫病毒Asia1亚型PCR 引物混合物	C	100μL（白盖）
口蹄疫病毒Asia1亚型 PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)	D	50μL（红盖）
DNA 病毒裂解液（试用装）	E	15 次（9 mL）
使用手册	F	1 份

储存条件：-20℃以下，有效期12个月。
使用方法：
一、样品采集：
1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验要求进行。
2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购上海泽叶生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

检测步骤：
三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个
样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	PCR 阳性 对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix （棕色管）	10 μL	10 μL	各 10 μL
口蹄疫病毒Asia1亚型 PCR 引物混合液（白盖）	2 μL	2 μL	各2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	2 μL
N+2 待测样品 DNA 模板	6 μL	不加	不加
第 7 步所得 PCR 阳性对照稀释液（2-7 号）	不加	不加	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：

	1循环	50℃ for 2 min
预变性	1循环	95℃ for 10min
PCR扩增	40循环	95℃ for 15s 60℃ for 60s

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
1）阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。 
2）阳性对照(ESKZ -PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤35。
3）以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
1）在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性。
2）Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明阪崎肠杆菌核酸阴性。
3）如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
4）对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
1）初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
2）所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
3）PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
4）样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
5）试剂盒里所有物品应视为污染物对待，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！