牛的线粒体 mRNA原位杂交试剂盒

库存 ：48

英文名 ：详见说明书

CAS号 ：详见说明书

保质期 ：一年

供应商 ：上海一研

保存条件 ：4°C保存

规格 ：100T/盒

杂交流程：
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+  90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours。
产品名称：牛的线粒体 mRNA原位杂交试剂盒
规格:100T/盒
特异性: 牛
标记方式: 3’—尾段标记
保存条件: 4°C保存一年
试剂盒内容:
1.牛的线粒体寡核苷酸探针杂交液    2ml；
2.预杂交液                     2ml；
3.胃蛋白酶（×10;Pepsin）       2ml；
4.封闭液                       5ml；
5.生物素化鼠抗           5ml；
6.SABC-POD                     5ml；
7.生物素化过氧化物酶           5ml。
培养细胞和冰冻切片：
牛的线粒体 mRNA原位杂交试剂盒准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。


原位杂交检测步骤：
原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1. 玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2. 样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3. 探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4. 原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
以下是公司正在热销的产品：
蝉花虫草  种属：Cordyceps sobolifera  描述 子座单个或数个从寄主头部生长出，有时虫体节部发出，橙黄色，一般不分枝，有时分枝，高3-5cm。头部呈棒状，长1-2cm，粗3-5mm，粗糙表面。子囊壳外露，近圆锥形，下部埋生于头部的外层，400-300μm×4-5μm，内含8枚线形孢子。孢子细长，几乎充满子囊，粗约1μm，成熟时产生横隔，并断成2-3μm长的小段。子座柄部近圆柱形，长2.5-4cm，粗2-4mm，内实心。
毛栓菌  种属：Trametes trogii  描述 子实体覆瓦状叠生。革质，无柄平伏而反卷，半圆形至贝壳状，往往相互连接，1－6cm×10cm，厚0.1－0.3（0.45）cm，有细长毛和绒毛，灰褐色、灰黑色、黑色等多种颜色，有光滑、狭窄多彩的同心环带，边缘薄、完整或波浪状。菌肉白色，厚0.5－1（1－1.5）mm。菌管长0.5－2（3）mm；管口白色、浅黄色或灰色，每毫米3－5个，孢子无色，光滑，长椭圆形，4.5－7.2μm×1.8－2.7μm
肺形侧耳(秀珍菇)  种属：Pleurotus pulmonarius  描述 纯白色，平滑，直径4－13cm，中部平或凸起 纯白色，长3－4cm，粗1－3cm 白色，变淡肉粉色或淡红褐色，有时皱曲 椭圆形，10.8－14×4.8－6μm 2－4小梗。
离褶伞  种属：Lyophyllum sp.  描述 野生子实体分离的双核菌丝，菌丝白，生长较慢
白鬼伞  种属：Leucocoprinus sp.  描述 革兰氏阳性、无芽孢的短杆状，菌落为橙黄色、中间隆起，菌落圆形，表面光滑，湿润，好氧，化能异养。能够降解三氯杀螨醇，7天内降解率大于60%。最适生长温度为30℃。
丛生地星  种属：Geastrum caespitasum  提供形式 斜面培养物
垂头虫草  种属：Cordyceps nutans  描述 子座单个或数个从寄主头部生长出，有时虫体节部发出，橙黄色，一般不分枝，有时分枝，高3-5cm。头部呈棒状，长1-2cm，粗3-5mm，粗糙表面。子囊壳外露，近圆锥形，下部埋生于头部的外层，400-300μm×4-5μm，内含8枚线形孢子。孢子细长，几乎充满子囊，粗约1μm，成熟时产生横隔，并断成2-3μm长的小段。子座柄部近圆柱形，长2.5-4cm，粗2-4mm，内实心。
大团囊虫草  种属：Elaphocordyceps ophioglossoides  提供形式 斜面培养物
树舌灵芝  种属：Ganoderma applanatum  描述 菌柄短，菌盖厚，子实体黑色。|
菌  种属：Laetiporus sulphureus  描述 无乳清环
网纹马勃  种属：Lycoperdon perlatum  描述 子实体较小，直径2.5~6CM，高2~8CM，梨形或陀螺形，不孕的基部发达。包被茶色，外包被由易脱落的颗粒状小疣组成。内包被膜质。孢体浅烟色。孢子青黄色，光滑，球形，直径3.5~4.5μm，具有10~12μm的小柄，孢丝与孢子同色，细长，分枝，相互交织，粗，3-7μm。
平菇  种属：Pleurotus sp.  描述 纯白色，平滑，直径4－13cm，中部平或凸起 纯白色，长3－4cm，粗1－3cm 白色，变淡肉粉色或淡红褐色，有时皱曲 椭圆形，10.8－14×4.8－6μm 2－4小梗。
毛木耳  种属：Auricularia polytricha  描述 子实体滑或略有皱纹，红褐色或棕褐色，干后变深褐色或黑褐色。外面有短毛，青褐色。担子细长, 柱形, 有三个横隔, 50～65μm×3.5～5.5μm。孢子无色，光滑，常弯曲，腊肠形，9～(16)17.5μm×5～7.5μm。
银丝草菇  种属：Volvariella bombycina  描述 子实体较大。菌盖直径5-19cm，近钟形，后伸展，中部稍凸起，干燥，灰色至灰褐色，中部色深，具辐射的纤毛线条。菌肉白色。松软，中部稍厚。菌褶白色，后变粉红，稍密，宽，离生，不等长，菌柄圆柱形，长5-18cm，粗0.8-1.5cm，白色或稍带黄色，光滑，内实。菌托较大，杯状，厚，白色至灰黑色，孢子印粉红色。孢子光滑，椭圆形，6-8.4×4-5.6μm。缘囊状体棍棒状，顶端突尖，95-100×16-35μm。
牛的线粒体 mRNA原位杂交试剂盒英文名称:Lactobacillus hammesii
中文名称hammesii乳杆菌
存储人:Valcheva et al.
来源历史:<< JCM << CIP << M. Korakli LP38.
其他保藏中心编号:CCUG 51325; CIP 108387; DSM 16381; LMG 23074; JCM 16170
分离来源:法国酸奶
菌种特性
备注：
培养条件：30°C
生物安全等级:1
氧气需求:
培养基:TSB培养基：16
LACTOBACILLI MRS BROTH (DIFCO 0881)
Proteose peptone No.3 10.0g
Beef extract 10.0g
Yeast extract 5.0g
Dextrose 20.0g
Tween 80 1.0g
Ammonium citrate 2.0g
CH3COONa 5.0g
MgSO4·7H2O 0.1g
MnSO4·H2O 0.05g
K2HPO4 2.0g
Distilled water 1.0L
Adjust pH to 6.2-6.5.
模式菌株:是