LncRNA 引物设计-十年资深qPCR引物设计经验分享及常用LncRNA数据库介绍

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在直播期间及直播结束有老师问道：LncRNA的qPCR引物如何设计？在设计的时候有没有需要特别注意的地方？如何能设计出好的qPCR引物。基于这些问题，总结自己10年qPCR引物设计经验分享给大家。
LncRNA的qPCR引物相比于编码基因，是要复杂。导致其复杂的原因并不是引物设计原则上有特别之处，而是在于有太多的LncRNA数据库，数据库之间往往没有关联，且不同数据库的维护也不尽相同。今天的文章分两块：LncRNA数据库介绍和LncRNA引物设计注意事项。

LncRNA数据库介绍
1、NCBI RefSeq
NCBI不多做介绍，通常LncRNA信息我们参考RefSeq数据库中的数据，RefSeq数据库中的数据参考数据，是经过人工审核，其数据信息可信，注释全面。RefSeq数据库中LncRNA的命名通常是NR_或者XR_开头，后面加数字，其外显子信息位置，数量信息非常完整。关于RefSeq数据库的介绍，感兴趣的老师可以查看文章《带你走入RefSeq数据库》，链接https://mp.weixin.qq.com/s/ZuE40OSnzxrMk_yrP-Y5ag。


2、Ensembl
相同的LncRNA，Ensembl数据库中信息往往要比NCBI多很多，特别是转录本数量。且数据变化非常快且变化会很大，可能昨天浏览这个数据库中某个LncRNA只有2个转录本，隔天再去看的时候，可能就变成3个甚至更多。NCBI就不同，尽管更新频率也非常的快，但是LncRNA的变化通常很小，转录本数量基本不变化，序列变化的可能性也非常的小。关于不同数据中的命名格式可以查看文章《不知道数据库命名规则怎么能真正了解数据库？》链接https://mp.weixin.qq.com/s/D6r2CD1qKj0iMNdYSoqrKQ。


3、UCSC
UCSC数据库的LncRNA数据个人认为更新相对较慢，但有些LncRNA名称如uc001ylu就需要前往UCSC数据库查询其序列信息。UCSC Genome Browser可以根据基因组的位置、基因ID、转录本等信息进行浏览查询。


4、RNAcentral
RNAcentral 整合了包括 Ensembl、GENCODE、Greengenes、HGNC、LNCipedia、lncRNAdb、miRbase、NONCODE、RDP、RefSeq、Rfam、SILVA 在内的多个数据库。


5、NONCODE
NONCODE是一款综合性的数据库，该数据库是一个比较全面的ncRNA相关注释的数据库，尤其是lncRNA信息，不仅支持常用lncRNA的Name、NONCODE Gene ID（例如：NONHSAG036681.2）搜索，部分lncRNA支持其他数据库名字进行搜索。该数据库目前收入了很多物种，主要是动物方面的，包括人、小鼠、大鼠、奶牛、鸡、果蝇、斑马鱼、线虫、酵母、拟南芥、黑猩猩、大猩猩、恒河猴、复鼠、鸭嘴兽、猩猩。数据库包含信息丰富，包括表达、功能、与疾病关系、染色体位置、序列保守性等，并可进行序列Blast搜索，同时支持数据下载。


6、Lncipedia
LNCipedia数据库整合了多个人类（Human）LncRNA数据库信息，很大程度上解决了LncRNA数据库各自为政的问题，这些数据库包括LncRNAdb、Broad Institute、Ensembl、Gencode、Refseq、NONCODE、FANTOM，同时还包括Nielsen, Hangauer等多篇文献中发现的LncRNA信息。目前已经更新到5.2版本，包括127,802 转录本序列和 56,946 条基因。


7、Lncrnadb
该数据库可以查询类似LINC00066, NCRNA00066名称的LncRNA。lncRNAdb数据库是一个真核生物的lncRNA综合数据库。它包括特异的序列结构信息，如转录本、基因组位置、表达、亚细胞定位和保守位点以及相关的功能和疾病。

数据库介绍总结：前面提到LncRNA的qPCR引物设计相比与编码基因确实要难，其原因就体现在LncRNA的数据库是在太多，而我们设计得到的qPCR引物通常都需要进行引物特异性比对，最好用的莫过于NCBI Primer-Blast，但是在特异性比对可供选择的比对数据库都只是NCBI，其他LncRNA数据库无法选择。接下来，小编就分享下非NCBI RefSeq来源的LncRNA的qPCR引物设计应该怎么做？

LncRNA 的qPCR引物设计注意事项
LncRNA的qPCR引物设计最主要的三个原则：跨外显子设计，特异性比对，引物位置。
1、跨外显子设计
跨外显子设计的目的就是避免基因组的污染，跨外显子设计有两种办法，具体见示意图：
（1）正向F引物和反向R引物落在不同的外显子上

此处注意：（a）如果产物大小允许，正向F引物和反向R引物可以落在不同的外显子上；（b）如果正向F引物和反向R引物只能落在两个相邻的外显子上，那优先选择内含子最大的两个外显子上。

（2）正向引物或者反向引物跨了两个外显子

此处注意：（a）如果能选择（1）就不要选择（2）方法设计，（2）设计方法引物位置受限，设计得到的引物参数可能不是最优。（b）如果选择（2）方法设计，那跨两个外显子的引物的3端序列不要跨第二个外显子太多序列，建议不要超过6个碱基，否则就相当于没有跨外显子设计。

2、特异性比对
从上述数据库中查到LncRNA的序列信息后，建议先使用NCBI进行比对，简单做一个核苷酸比对和基因组比对。核苷酸比对的目的是看看这条LncRNA有没有与NCBI RefSeq同源性较高的序列信息。如果有，可能涉及到需要判断他们是否是同一条基因的问题。基因组比对的目的是简单判断其外显子个数组成，因为有些LncRNA数据库可能没有提供外显子数量信息和外显子位置信息。比对其实就是一个不同数据库之间LncRNA信息的转换，当统一后，那LncRNA引物设计就容易许多。
关于NCBI blast Database选择问题可以查看文章《使用NCBI做BLAST，我应该选择哪个Database？》，链接https://mp.weixin.qq.com/s/dKGH_GvNzhO_ofRTUuAbEQ。

3、引物位置
引物尽量不要落在LncRNA序列两端100bp序列以内，原因是防止两端序列不准确。曾经碰到一个老师，自己使用RACE验证Ensembl数据库中的LncRNA序列，发现两端序列有缺失。

4、同源区设计
本人设计qPCR引物通常都选择在同源区设计，检测其总RNA情况，具体根据各自实验要求而定。这里不多做展开介绍。