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2020年1月6日，国际顶尖学术期刊 Science 发表了一篇报导：Virus used in gene therapies may pose cancer risk, dog study hints。该报道称，这项针对狗的血友病的新研究表明，AAV 病毒可以轻易将其携带的基因插入到宿主的 DNA 中，并且插入位置靠近调控细胞生长的基因，有诱发癌症的可能性。
该项研究结果同样也带来一个好消息。美国国家人类基因组研究所的基因治疗研究员Charles Venditi表示“基因整合到染色体上而不是呈游离状态，其治疗效果会更持久”。正如女王大学（Queen’s University）的物理学家 David Lillicrap 所说，“如果一个蛋白质需要长期表达，那么这种插入是很重要的”。今天小编自问自答整理了关于腺相关病毒(AAV)的十个问题，相信这自问自答的十个问题能说明AAV依然是基因治疗明星载体。
1、腺相关病毒(AAV)的不同血清型为什么具有不同的细胞/组织嗜性和转导效率？
原因是：腺相关病毒(AAV)的这些特性高度依赖于AAV衣壳氨基酸序列，衣壳结构及其与宿主细胞因子的相互作用，包括细胞表面受体，共受体，信号分子，宿主DNA复制中涉及的蛋白质和宿主来源的抗体。
这篇文章讲述了有关AAV衣壳和衣壳病毒蛋白区域的当前结构信息，这些蛋白在赋予感染表型的细胞相互作用中起作用，然后用于注释衣壳的功能区域。根据目前的数据，AAV已经进化出具有保守核心区域的多功能衣壳，这是有效衣壳运输的必要条件，衣壳装配和基因组包装。不同的表面环结构赋予差异受体识别，并参与抗体识别。
2、腺相关病毒(AAV)为什么能长时间表达？特别是一些神经元细胞，持续表达时间甚至可以长达两年以上。
原因是：腺相关病毒(AAV)基因组在细胞核中的存留主要是以环状的dsDNA附加体（circularised dsDNA episomes）。AAV基因组在附加体中存续的能力仅依赖于细胞蛋白将线性基因组转化为稳定的环状和串联结构。可以推断这些合成的DNA中间体有助于体内长期基因表达。
文章描述了描述了当载体拷贝数达到稳定状态（即基因转移后数月）时，非人类灵长类动物骨骼肌中的rAAV载体基因组结构。载体基因组以游离单体和串联体的形式持续存在，其结构与染色质一致。苯丁酸钠对之前用rAAV载体肌肉内转导的灵长类动物的给药不会增加转基因的表达，这表明大多数持久性载体基因组都保持着染色质构型，这说明了长期的转基因表达。与组蛋白同化的rAAV基因组的结构可能开始解释载体基因组附加体的长期持久性和非分裂组织中的转基因表达。
3、超过了腺相关病毒(AAV)的包装容量（AAV的基因组大小小于4.8 kb）还能包装AAV吗？
当然是可以的。使用双AAV载体系统即可以，可以让包装容量达到8k。文章“Dual AAV gene therapy for Duchenne muscular dystrophy with a 7kb mini-dystrophin gene in the canine model” 报告了在杜兴肌营养不良（DMD）犬模型中使用一对双AAV载体让7 kb犬ΔH2-R15小型肌营养不良蛋白基因表达。这项技术让大基因包装腺相关病毒(AAV)成为可能。
4、腺相关病毒(AAV)的靶向性/特异性非常好，是如何做到的？
原因是：有几种不同的措施或者方法可以驱动特定细胞/组织中的基因表达；这些包括启动子，Flp或Cre依赖性基因开关，以及血清型。如果您打算广泛表达，那么广泛活性的启动子，例如CMV_bGlobin（由CMV启动子和betaGlobin intron组成）是一个不错的选择。如果您具有特定的靶细胞类型，则可能需要尝试其他启动子，例如Camk2a是特定于神经元的。另一方面，可以将具有Cre或Flip依赖性基因表达的rAAV载体注射到在特定细胞类型中具有Cre或Flp表达的动物中，这样能过做到仅在这些细胞中表达基因。
5、腺相关病毒(AAV)载体表达时间需要7-14天，还能更快吗？
答案当然是肯定的。文章“Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus (scAAV) Vectors Promote Efficient Transduction Independently of DNA Synthesis”通过改造其中的一个ITR使得腺相关病毒(AAV)形成二聚体或自身互补的AAV（称为scAAV）。与标准单链ssAAV相比，scAAV载体显示起效快和更高水平的转基因表达。这种序列的优点在于它不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录，与传统的单链AAV基因组相比，它的基因表达更为迅速，而且表达量更高。但是，它们的包装容量（<2.5Kb）是ssAAV的一半（<4.8Kb），限制了可以成功包装的基因和载体可以有的调控元件的数量。
6、腺相关病毒(AAV)相比其他基因递送工具比如慢病毒和腺病毒更适合动物实验，那如何保证动物实验的效果呢？
病毒滴度非常重要。可以决定传递到组织的病毒颗粒的数量取决于病毒制备的滴度和可以传递的最大体积，这一点非常重要。您可以先从文献中搜索有关特定组织的建议，但是，通常需要通过尝试一系列稀释来确定体内实验最佳剂量，其次还有动物的年龄，观察时间，以及注射方式方法都会影响动物实验的效果。
7、腺相关病毒(AAV)都有方面的应用，适合哪些组织？
腺相关病毒(AAV)载体在骨骼肌基因治疗，肝脏基因治疗，中枢神经系统基因治疗，视网膜退行性疾病的基因治疗以及心脏相关疾病的基因治疗等方面都有应用。
8、腺相关病毒(AAV)可以用于基因组编辑吗？
SaCas9（Staphylococcus aureus Cas9）的出现使腺相关病毒(AAV)用于基因组编辑成为可能。研究证实SaCas9产生的Indel的效率与SpCas9相似。文章“In Vivo Genome Editing Using Staphylococcus Aureus Cas9” 将SaCas9及其单个sgRNA表达盒包装到单个AAV载体中，并靶向小鼠肝脏中的胆固醇调节基因Pcsk9。在注射后的一周内观察到了>40％的基因修饰，同时血清Pcsk9和总胆固醇水平显着降低。文章使用BLESS进一步评估了SaCas9和SpCas9的全基因组靶向特异性，证明了SaCas9介导的体内基因组编辑具有高效和特异性的潜力。
9、腺相关病毒(AAV)临床应用情况
迄今为止，AAV载体AAV1，AAV-2，AAV-6，AAV-7，AAV-8，AAV-9和AAVrh10已用于超过183个基因治疗试验中。这些临床试验针对的疾病包括但不限于B型血友病，LPL缺乏症，囊性纤维化，肌营养不良，帕金森氏病和HIV。
10、腺相关病毒(AAV)挑战有哪些？
（1）预先存在的免疫力：许多人体内已经有野生型AAV，因此可能已经有了预防AAV感染的方法。这些预先存在的抗体可能会干扰病毒与细胞的相互作用，并严重阻碍基因治疗的结果。
（2）免疫系统生成的抗AAV抗体：患者自身的免疫系统可以生成抗体，以中和用于治疗它们的AAV载体。科学家正在努力通过直接进化，衣壳改组和肽展示来开发新的衣壳来克服这个问题。新的衣壳这些衣壳将会具有逃避免疫系统的能力和增强的感染靶组织的能力。通过控制基因表达和选择特异性启动子提高特异性，也可能有助于AAV载体逃避宿主免疫。
结语
腺相关病毒(AAV)是之所以作为基因治疗明星载体，因为：1）它们的基因组易于操作，2）它们能够长期表达； 3）毒性有限。然而，使用AAV进行神经科学研究的关键挑战是缺乏一种操纵整个大脑神经元的方法。CNS的周围神经系统（PNS）连接到心脏，肺，肠和其他器官的神经元，也是基因传递的重要目标，尤其是对疼痛的研究。吉凯基因有特异子库，涉及心脏，血管，肝脏，骨骼，肌肉，神经，眼睛，脂肪，胰腺等不同组织的启动子，同时开发整理针对特定组织的特异性血清型，欢迎前来咨询。
参考文献：
1.Jocelyn Kaiser. Virus used in gene therapies may pose cancer risk, dog study hints. Science Jan. 6, 2020 , 8:00 AM. doi:10.1126/science.aba7696
2.Agbandje-McKenna M, Kleinschmidt J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol Biol. 2011;807:47–92. doi:10.1007/978-1-61779-370-7_3
3.Penaud-Budloo M, Le Guiner C, Nowrouzi A, et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. J Virol. 2008;82(16):7875–7885. doi:10.1128/JVI.00649-08
4.Kodippili K, Hakim CH, Pan X, et al. Dual AAV Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy with a 7-kb Mini-Dystrophin Gene in the Canine Model. Hum Gene Ther. 2018;29(3):299–311. doi:10.1089/hum.2017.095
5.McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 2001;8(16):1248–1254. doi:10.103/sj.gt.3301514
6.Ran FA, Cong L, Yan WX, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015;520(7546):186–191. doi:10.1038/nature14299
7.Wang et al, (2019). Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery.doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9
该项研究结果同样也带来一个好消息。美国国家人类基因组研究所的基因治疗研究员Charles Venditi表示“基因整合到染色体上而不是呈游离状态，其治疗效果会更持久”。正如女王大学（Queen’s University）的物理学家 David Lillicrap 所说，“如果一个蛋白质需要长期表达，那么这种插入是很重要的”。今天小编自问自答整理了关于腺相关病毒(AAV)的十个问题，相信这自问自答的十个问题能说明AAV依然是基因治疗明星载体。
1、腺相关病毒(AAV)的不同血清型为什么具有不同的细胞/组织嗜性和转导效率？
原因是：腺相关病毒(AAV)的这些特性高度依赖于AAV衣壳氨基酸序列，衣壳结构及其与宿主细胞因子的相互作用，包括细胞表面受体，共受体，信号分子，宿主DNA复制中涉及的蛋白质和宿主来源的抗体。
这篇文章讲述了有关AAV衣壳和衣壳病毒蛋白区域的当前结构信息，这些蛋白在赋予感染表型的细胞相互作用中起作用，然后用于注释衣壳的功能区域。根据目前的数据，AAV已经进化出具有保守核心区域的多功能衣壳，这是有效衣壳运输的必要条件，衣壳装配和基因组包装。不同的表面环结构赋予差异受体识别，并参与抗体识别。
2、腺相关病毒(AAV)为什么能长时间表达？特别是一些神经元细胞，持续表达时间甚至可以长达两年以上。
原因是：腺相关病毒(AAV)基因组在细胞核中的存留主要是以环状的dsDNA附加体（circularised dsDNA episomes）。AAV基因组在附加体中存续的能力仅依赖于细胞蛋白将线性基因组转化为稳定的环状和串联结构。可以推断这些合成的DNA中间体有助于体内长期基因表达。
文章描述了描述了当载体拷贝数达到稳定状态（即基因转移后数月）时，非人类灵长类动物骨骼肌中的rAAV载体基因组结构。载体基因组以游离单体和串联体的形式持续存在，其结构与染色质一致。苯丁酸钠对之前用rAAV载体肌肉内转导的灵长类动物的给药不会增加转基因的表达，这表明大多数持久性载体基因组都保持着染色质构型，这说明了长期的转基因表达。与组蛋白同化的rAAV基因组的结构可能开始解释载体基因组附加体的长期持久性和非分裂组织中的转基因表达。
3、超过了腺相关病毒(AAV)的包装容量（AAV的基因组大小小于4.8 kb）还能包装AAV吗？
当然是可以的。使用双AAV载体系统即可以，可以让包装容量达到8k。文章“Dual AAV gene therapy for Duchenne muscular dystrophy with a 7kb mini-dystrophin gene in the canine model” 报告了在杜兴肌营养不良（DMD）犬模型中使用一对双AAV载体让7 kb犬ΔH2-R15小型肌营养不良蛋白基因表达。这项技术让大基因包装腺相关病毒(AAV)成为可能。
4、腺相关病毒(AAV)的靶向性/特异性非常好，是如何做到的？
原因是：有几种不同的措施或者方法可以驱动特定细胞/组织中的基因表达；这些包括启动子，Flp或Cre依赖性基因开关，以及血清型。如果您打算广泛表达，那么广泛活性的启动子，例如CMV_bGlobin（由CMV启动子和betaGlobin intron组成）是一个不错的选择。如果您具有特定的靶细胞类型，则可能需要尝试其他启动子，例如Camk2a是特定于神经元的。另一方面，可以将具有Cre或Flip依赖性基因表达的rAAV载体注射到在特定细胞类型中具有Cre或Flp表达的动物中，这样能过做到仅在这些细胞中表达基因。
5、腺相关病毒(AAV)载体表达时间需要7-14天，还能更快吗？
答案当然是肯定的。文章“Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus (scAAV) Vectors Promote Efficient Transduction Independently of DNA Synthesis”通过改造其中的一个ITR使得腺相关病毒(AAV)形成二聚体或自身互补的AAV（称为scAAV）。与标准单链ssAAV相比，scAAV载体显示起效快和更高水平的转基因表达。这种序列的优点在于它不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录，与传统的单链AAV基因组相比，它的基因表达更为迅速，而且表达量更高。但是，它们的包装容量（<2.5Kb）是ssAAV的一半（<4.8Kb），限制了可以成功包装的基因和载体可以有的调控元件的数量。
6、腺相关病毒(AAV)相比其他基因递送工具比如慢病毒和腺病毒更适合动物实验，那如何保证动物实验的效果呢？
病毒滴度非常重要。可以决定传递到组织的病毒颗粒的数量取决于病毒制备的滴度和可以传递的最大体积，这一点非常重要。您可以先从文献中搜索有关特定组织的建议，但是，通常需要通过尝试一系列稀释来确定体内实验最佳剂量，其次还有动物的年龄，观察时间，以及注射方式方法都会影响动物实验的效果。
7、腺相关病毒(AAV)都有方面的应用，适合哪些组织？
腺相关病毒(AAV)载体在骨骼肌基因治疗，肝脏基因治疗，中枢神经系统基因治疗，视网膜退行性疾病的基因治疗以及心脏相关疾病的基因治疗等方面都有应用。
8、腺相关病毒(AAV)可以用于基因组编辑吗？
SaCas9（Staphylococcus aureus Cas9）的出现使腺相关病毒(AAV)用于基因组编辑成为可能。研究证实SaCas9产生的Indel的效率与SpCas9相似。文章“In Vivo Genome Editing Using Staphylococcus Aureus Cas9” 将SaCas9及其单个sgRNA表达盒包装到单个AAV载体中，并靶向小鼠肝脏中的胆固醇调节基因Pcsk9。在注射后的一周内观察到了>40％的基因修饰，同时血清Pcsk9和总胆固醇水平显着降低。文章使用BLESS进一步评估了SaCas9和SpCas9的全基因组靶向特异性，证明了SaCas9介导的体内基因组编辑具有高效和特异性的潜力。
9、腺相关病毒(AAV)临床应用情况
迄今为止，AAV载体AAV1，AAV-2，AAV-6，AAV-7，AAV-8，AAV-9和AAVrh10已用于超过183个基因治疗试验中。这些临床试验针对的疾病包括但不限于B型血友病，LPL缺乏症，囊性纤维化，肌营养不良，帕金森氏病和HIV。
10、腺相关病毒(AAV)挑战有哪些？
（1）预先存在的免疫力：许多人体内已经有野生型AAV，因此可能已经有了预防AAV感染的方法。这些预先存在的抗体可能会干扰病毒与细胞的相互作用，并严重阻碍基因治疗的结果。
（2）免疫系统生成的抗AAV抗体：患者自身的免疫系统可以生成抗体，以中和用于治疗它们的AAV载体。科学家正在努力通过直接进化，衣壳改组和肽展示来开发新的衣壳来克服这个问题。新的衣壳这些衣壳将会具有逃避免疫系统的能力和增强的感染靶组织的能力。通过控制基因表达和选择特异性启动子提高特异性，也可能有助于AAV载体逃避宿主免疫。
结语
腺相关病毒(AAV)是之所以作为基因治疗明星载体，因为：1）它们的基因组易于操作，2）它们能够长期表达； 3）毒性有限。然而，使用AAV进行神经科学研究的关键挑战是缺乏一种操纵整个大脑神经元的方法。CNS的周围神经系统（PNS）连接到心脏，肺，肠和其他器官的神经元，也是基因传递的重要目标，尤其是对疼痛的研究。吉凯基因有特异子库，涉及心脏，血管，肝脏，骨骼，肌肉，神经，眼睛，脂肪，胰腺等不同组织的启动子，同时开发整理针对特定组织的特异性血清型，欢迎前来咨询。
参考文献：
1.Jocelyn Kaiser. Virus used in gene therapies may pose cancer risk, dog study hints. Science Jan. 6, 2020 , 8:00 AM. doi:10.1126/science.aba7696
2.Agbandje-McKenna M, Kleinschmidt J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol Biol. 2011;807:47–92. doi:10.1007/978-1-61779-370-7_3
3.Penaud-Budloo M, Le Guiner C, Nowrouzi A, et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. J Virol. 2008;82(16):7875–7885. doi:10.1128/JVI.00649-08
4.Kodippili K, Hakim CH, Pan X, et al. Dual AAV Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy with a 7-kb Mini-Dystrophin Gene in the Canine Model. Hum Gene Ther. 2018;29(3):299–311. doi:10.1089/hum.2017.095
5.McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 2001;8(16):1248–1254. doi:10.103/sj.gt.3301514
6.Ran FA, Cong L, Yan WX, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015;520(7546):186–191. doi:10.1038/nature14299
7.Wang et al, (2019). Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery.doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9
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