Caspase3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒规格

库存 ：51

CAS号 ：详见说明书

保质期 ：详见说明书

供应商 ：上海研生

保存条件 ：低温冷藏

规格 ：100T|50T

培养操作步骤：
1．Caspase3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒规格用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布； 
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）； 
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时； 
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中； 
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。 
中文名称：Caspase3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒规格
英文名称：
产品规格：100T|50T
发货周期：1～3天
凋亡早期的重要特征之一是半胱氨酸特异性蛋白酶——caspase家族蛋白的活性激活。这一类酶可以参与到一系列的生化反应中，响应凋亡早期信号并导致相应的蛋白底物剪切，继而引发细胞解体。目的底物可识别的序列包含天门冬氨酸残基，剪切发生在序列的羰基段。
Caspase3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒采用新型的荧光底物为原料，可以检测凋亡细胞中激活的caspase3/7.这种具有膜亲和型的检测试剂盒由一个4氨基的小肽（DEVD）和一种核酸结合染料。凋亡发生时，caspase3/7蛋白被激活，从而剪切caspase3/7识别序列DEVD肽段。剪切底物后，游离的核酸染料与DNA结合，从而发出亮绿色荧光信号。
操作步骤
1.1以合适的培养基悬浮细胞或贴壁细胞，加入合适的化合物或药物，刺激细胞诱导凋亡。
1.2去除药物或化合物，以新鲜培养基洗涤细胞2-3次，更换新鲜培养基后，以1μL/mL的量加入caspase3/7检测液，使得caspase3/7检测试剂工作液浓度为1μM。（注意Caspase3/7检测试剂工作液浓度为0.5μM~2μM，您根据细胞量以及培养液的体积进行调整优化。）
1.337℃，避光孵育30min，或室温孵育45-60min。
1.4荧光显微镜观察拍照或荧光光度计读数。
实验报告：
一、分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
注意事项：
      尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，但为取得良好的使用效果，3-6个月内推荐4℃保存，并适当注意避免反复冻融。
      如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
      染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
      如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。
      荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
      用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
      需自备PBS。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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