QuickMutation™基因定点突变试剂盒

保存条件 ：-20℃保存

保质期 ：一年有效

供应商 ：碧云天（beyotime）

规格 ：10次

碧云天生产的QuickMutation™基因定点突变试剂盒(QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成质粒DNA的点突变(point mutation)，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)突变。
基因定点突变常用于研究基因的转录调控、RNA或蛋白质的结构和功能，以及用于质粒中部分序列的微调等。
本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术，只需通过基于PCR的突变质粒的生成，和基于DpnI的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒 (参考图1)。DpnI消化仅需5分钟，累计操作时间不足2小时即可完成
基因的定点突变。

图1.基因定点突变试剂盒原理图

本试剂盒使用了保真性更强，灵敏度更高，扩增速度可达2kb/min，扩增长度可达12kb的BeyoFusion™ DNA Polymerase，从而大大缩短了突变反应所需的时间，进一步提高了基因定点突变的成功率。同时进一步严格验证了试剂盒中的DpnI，确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒，同时不会消化未甲基化的PCR产物。
参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25-45个碱基互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于DH5α等dam⁺大肠杆菌，在这些dam⁺细菌中质粒会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
本试剂盒分别使用6kb和12kb的质粒进行了点突变测试，实测突变率接近100%(参考图2)。实际进行点突变时，可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率。

图2. 本试剂盒实际使用效果图。A. 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片。以一个6kb质粒为模板，使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变，DpnI 37℃消化5min，取10μl产物转化100μl DH5α感受态，涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片。B. 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BeyoFusion™ DNA Polymerase，这样模板质粒完全被DpnI酶所消化，没有任何的假阳性克隆产生。C. 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT, wild type)和从图A中挑取9个克隆的测序结果(Mu,mutant)。箭头所示为拟突变的位点，红色下划线的为突变前和突变后的碱基。本次实验的突变率达到了100%。

本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。