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文献和实验
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库存 :249
英文名 :First Strand cDNA Synthesis Kit
保质期 :一年
供应商 :北京百奥莱博科技有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :50T
特别提示:包括第一条链 cDNA合成试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:第一条链 cDNA合成试剂盒
英文名称:First Strand cDNA Synthesis Kit
产品货号:SY0290
产品规格:50T
本试剂盒是基于Reverse Transcriptase,该酶热稳定性提高,在50℃的半衰期超过240min,且可长时间耐受高达55℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录,能稳定可靠地合成cDNA。且Reverse Transcriptase的独特设计,进一步增强了模板亲和力和行进性,使得全长cDNA的合成能力有了大幅度提升,可获得长达20 kb的cDNA,并且对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度,非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。
本试剂盒包含由总RNA或mRNA合成高质量第一条链cDNA所需的所有成分,并提供两种cDNA合成引物:Random hexamers和oligo(dT)18。合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR、qPCR以及PCR克隆。其中,5×RT Mix包含优化的缓冲体系和dNTP; Enzyme Mix包含Reverse Transcriptase和RNase inhibitor。可根据需要,选择Oligo (dT)18、Random hexamers或基因特异引物作为逆转录引物。
试剂盒组分:
组份 | 规格 |
RNase free ddH2O | 1 ml |
5×RT Mix | 200 μl |
Enzyme Mix* | 50 μl |
Oligo dT18 (0.5 μg/μl) | 50 μl |
Random hexamers (N6) | 50 μl |
*包含RNase inhibitor,用于抵抗环境和体系中可能存在的痕量的RNase。 |
储存条件:-20℃,有效期一年。
质量控制
所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、RNase残留。
功能检测1:以500 ng mouse total RNA为模板,Oligo dT18为引物,50℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增nebulin基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的20.0 kb条带。
功能检测2:以100 pg Hela cell total RNA为模板,Oligo dT18为引物,50℃反应30分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的550 bp条带。
功能检测3:以500 ng Hela cell total RNA为模板,Oligo dT18为引物,55℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。
功能检测4:以1 pg-1 µg HeLa cell total RNA为模板,以Oligo dT18和Random hexamers为引物,测试qRT-PCR性能。
以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线,R2>0.990,斜率在-3.20到-3.60之间。
客户需要准备的材料
1.RNase free的1.5 ml微量离心管或0.2ml PCR管
2.水浴锅或PCR仪
3.冰
4.RNA(高质量的完整的RNA对于获得高质量的cDNA是至关重要的。
引物选择
1) 如果模板为真核生物来源,建议选择Oligo dT18,其与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。
2)基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时,可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。
3)Random hexamers特异性最低,所有RNA,包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时,可使用Random hexamers为引物。
应用实例
1 第一条链cDNA合成*(以20μl反应体系为例)
1)按照下表在RNase free离心管中配制如下混合液:
RNase free ddH2O | to 20 μl |
Oligo(dT)18(0.5 μg /μl) | 1 μl |
or Random Primer | or 1 μl |
or Gene Speicific Primers | or 2 pmol |
5×RT Reaction Mix | 4 μl |
Enzyme Mix** | 0.8-1μl |
模板RNA | Total RNA: 50 ng-5 μg/mRNA: 5-500 ng |
*可选步骤(一般不需要):如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构,可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀,65℃变性5分钟,冰上冷却 5min,短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。
** Enzyme Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请瞬时离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。可每次按照0.8μl使用,不会影响使用效果。
2)用移液枪轻轻吹打混匀。
3)如用Oligo(dT)18或基因特异引物(GSP),42℃孵育30-50min。
如用Random Primer,25℃孵育10 min,42℃孵育30-50 min。
4)65℃加热15 min(或者85℃加热5 min)失活Reverse Transcriptase。
2 RT-PCR
建议取1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为PCR模板。
1)建议反应条件
Components | Volume | Final Concentration |
cDNA Template | 2 μl | as required |
Forward Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM each |
Reverse Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM each |
10×Taq Buffer (含Mg2+) | 5 μl | 1× |
2.5 mM dNTPs | 4 μl | 0.2 mM |
Taq DNA Polymerase | 0.5 μl | 2.5 units |
ddH2O to final volume | 50 μl | Not applicable |
注意事项
1)所有操作均应在冰上进行。
2)除使用RNase free的枪头和离心管外,RNA实验用的试剂建议专用,并在单独的洁净的区域操作。操作时,戴上口罩和一次性手套,避免说话。总RNA提取完成后,建议取少量跑1%琼脂糖凝胶电泳,检验RNA的完整性。
3)逆转录反应抑制物包括酚,盐,SDS,EDTA等。建议用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔细洗涤RNA沉淀 (轻弹管底让沉淀悬浮,并静置数分钟)。
4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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