引物上新｜三大数据库基因全覆盖

1、NCBI Refseq（NCBI Reference Sequence）数据库中基因类型为lncRNA，protein-coding，pseudo的全部基因；
2、mirbase数据库中human，mouse，rat全部成熟体序列microRNA；
3、circbase数据库中human，mouse全部circRNA；
其次，也是最重要的，就是基因坚持的三个最重要的设计原则：
1、引物跨内含子设计，避免基因组污染带来的影响；
2、引物在基因（NCBI Refseq）对应的所有转录本同源区设计；
3、引物特异性，设计引物全部使用NCBI primer-blast比对工具进行引物特异性比对；
最后，就是设计方法。qPCR使用的方法都是是染料法，使用的荧光染料就是常用的SYBRGreen I。该方法利用了SYBRGreen荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性，检测PCR的全部进程，从而判定初始RNA的量。染料法的优势是使用简单，成本也相对较低。下面简单介绍下mirbase数据库和circbase数据库中两类基因的qPCR引物设计方法。
1、circbase数据库中circRNA引物设计方法-常规qPCR设计方法
CircRNA成环方式有很多种，简单说明下外显子环化的circRNA和内含子环化的circRNA两类设计方法。对于外显子环化的circRNA，引物需要跨剪切位点（backsplice）设计；对于内含子环化circRNA，可跨剪切位点设计，也可围绕内含子区域设计引物。circRNA的正向引物和反向引物（Divergent PCR ）与线性mRNA的正向引物和反向引物（convergent PCR）设计方向刚好是相反的。circRNA跨剪切位点（backsplice）设计示意图如下：

2、mirbase数据库中成熟体microRNA引物设计方法-茎环法
由于成熟体miRNA较小，无法用常规的方法直接进行反转录、PCR 。所以对于mirbase数据库中的成熟体microRNA使用的是茎环法，也就是将miRNA配对的序列延长，然后进行正常的反转录及后续的PCR检测。茎环法原理图如下：

引物产品具有高扩增效率和高灵敏度的特点，保证每次实验的可靠定量，无非特异性扩增和引物二聚体，确保实验的可重复性和实验数据的可靠性。