PUREfrex(R)2.0 重组无细胞蛋白质合成系统

新开发的重组无细胞蛋白质合成系统

PUREfrex® 2.0

 

◆背景

 

　　PUREfre试剂盒是基于东京大学Takuya Ueda教授发明的PURE系统技术而新开发的一种重组无细胞蛋白质合成试剂。

　 　反应系统由蛋白质、核糖体、氨基酸和NTPs组成（参考文献1,2），其中，蛋白质具有转录、翻译和能量再生的功能。蛋白质与核糖体分别单独高度纯化后组装成蛋白质合成系统，当合成蛋白质时，只需添加编码所需蛋白质的模板DNA或mRNA到反应混合液中并放置几个小时。重组系统只与组装、翻译相关因素有关，并根据需要来调整反应混合物的成分，而不必考虑高背景对下游应用的影响。

　 　改进PUREfrex试剂盒组分纯化过程后，大大降低了RNA酶与β-半乳糖苷酶的污染。此外，每1 L PUREfrex反应混合物消耗低于0.1EU的脂多糖（LPS）。PUREfrex试剂盒的所有蛋白组分没有用于纯化与检测的标记，允许使用任何标记与蛋白质结合纯化产物。

 

 

◆应用

 

用于制备以下蛋白质

●　原核蛋白

●　真核蛋白

●　膜蛋白

●　二硫键蛋白质

●　含有非天然氨基酸的蛋白质等

 

蛋白质科学基础研究

●　翻译

●　蛋白质合成后折叠

 

用于体外显示

●　核糖体展示技术

●　mRNA展示技术

 

◆特点与优点

 

　 　PUREfrexTM试剂盒采用仅由翻译系统组成的PURE系统创新技术，此改进提高了试剂盒组分纯度。表1表示PUREfrexTM试剂盒与创新PURE系统纯化方法的比较。每1 L PUREfrexTM反应混合物消耗低于0.1EU脂多糖，并降低了核糖核酸酶与β-半乳糖苷酶的污染（图1）。

　　此外，已经审查每个部件处于完好活性，PUREfrexTM试剂盒各部件没有用于纯化与检测的标记，允许任何标记与蛋白质结合。图2是用组氨酸标记的合成蛋白质纯化结果。

 

 

	PUREfrexTM	原始
蛋白质
标记	无	组氨酸标记
列数	3	1
清洗剂清洗	+	-
核糖体
清洗剂清洗	+	-
转运RNA
清洗剂清洗	+	-

 

Original*；The reaction mixture prepared according to Shimizu et al.(2005) Methods,vol.36,p.299

表1 PUREfrexTM与创新PURE系统的组分纯化方法比较。

 

 

 

图1PUREfrexTM与原始PURE系统中反应混合物受污染情况的比较

 

 

测量并比较LPS含量及RNA酶与β-半乳糖苷酶活性，以此比较PUREfrexTM与创新PURE系统中反应混合物受污染的量。

将创新PURE系统（参考文献2）的量与活性设置为100。与创新PURE系统中污染物含量相比，PUREfrexTM系统中污染物含量较低。

 

 

使用PUREfrexTM合成具有组氨酸标记的GFP（His标记），并用金属螯合树脂纯化。

图2显示仅需一步即可完成高纯度纯化合成的His标记蛋白质。

 

 

◆活细胞研究的其他优点

 

●　无需遗传转化

●　无需考虑培养条件

●　无需考虑表达所需的诱导条件

●　无需考虑纯化条件

 

◆PUREfrex 2.0 与DS 补充剂

 

●　升级为PUREfrex 2.0系列！

●　大大提高合成数量！

●　提供小包装、低价格的试用装 。

●　合成数量大大提高！（-10倍次数）

●　在保证PUREfrex特性的基础上改进了反应试剂成分（减少RNA酶、β-半乳糖苷酶和脂多糖（LPS）的污染），并提高合成效率。

●　用于250ul或5 * 250ul反应（版本1用于500ul反应）

 

 

 

 

◆试剂盒组成

 

用于250ul反应

 

试剂	容量	说明	保存
试剂I (白色)	125 L	氨基酸，核苷酸，转运RNA和酶底物等。	-20°C
试剂I (白色)	12.5 L	溶解在30％甘油缓冲液中的蛋白质	-20°C or -80°C*1
试剂III (红色)	12.5 Lx2	核糖体（20μM）	-80°C*1
DHFRDNA（clear）*2 Sequence (text)	10 L	含有编码大肠杆菌DHFR基因的PCR产物（20ng / L）。	-20°C

 

 

（1）   剩余的溶液应快速在液氮、干冰或乙醇中冻结，并储存于-80℃。如有必要，分装剩余溶液，并尽可能避免反复冻融。

（2）   在合成DHFR的 50μL反应液中加入2.5μLDHFR DNA。