SPiDER-βGal 利用活细胞分析lacZ报告基因的表达

利用活细胞分析lacZ报告基因的表达

SPiDER-βGal

 

　 　SPiDER-βGal是检测具有细胞膜透过性及细胞内滞留性β-galactosidase的新型试剂。SPiDER-βGal具有较高的细胞膜透过性，因此可使用活细胞分析分析lacZ报告基因的表达。色素保留在细胞内，不会向外流出。因而，可进行单细胞层面的高灵敏度成像。

 

               

◆原理

 

　　SPiDER-βGal与β-galactosidase发生反应，生成名为quinone methide（醌甲基化物）的中间体，与附近的蛋白质中的亲核基团(SH基等)结合，形成稳定的共价键，从而具备荧光性质。

　　反应后的色素被固定在细胞内的蛋白质，滞留在胞内，可在单个细胞层面检测β-galactosidase表达细胞。

 

 

 

◆特点

 

　　●　可使用活细胞或组织进行单个细胞层面的表达细胞荧光成像，亦可使用X-gal等固定细胞

　　●　为探测物不向外流出，使用比以往更高灵敏度的β-galactosidase的荧光探针进行检测

 

                           β-galactosidase稳定细胞系HEK/lacZ 细胞（活细胞）的染色实例

                       黄色 : SPiDER-βGal    蓝色 : Hoechst 33342（※lacZ 表达细胞与未表达细胞以1 : 1比例混合）

 

 

 

◆利用SPiDER-βGal检测β-galactosidase

 

　　SPiDER-βgal可对固定细胞及活细胞进行染色，即使染色后进行固定化，也不会对色图产生影响。

 

 

 

 

◆固定化对染色的影响

 

　　细胞固定化会使GFP的荧光强度下降。但是，使用SPiDER-βgal进行染色，即使是固定细胞也具有较强的荧光性。

 

　　利用GFP-lacZ 融合质粒DNA，同时表达GFP及β-galactosidase的HeLa细胞的荧光色图

 

◆案例分析

 

果蝇组织的Live成像

 

 

 

　　用10 μmol/l SPiDER-βGal 和16 μmol/l Hoechst 33342对未固定的果蝇组织染色20-30分钟，共聚焦显微镜观察。
　　黄色：SPiDER-βGal
　　蓝色：Hoechst 33342

　　利用SPiDER-βGal在细胞内的高保留性，几乎完全不会渗出到邻近细胞；只对β-galactosidase（β-半乳糖苷酶）表达细胞进行单细胞层面染色。

 

 

老化细胞染色实例

 

　　利用H2O2老化诱导WI-38细胞的荧光显微镜及流式细胞仪分析

 

　　●　荧光显微镜下，通过SPiDER-βGal的荧光可以清晰观察到老化诱导的活细胞中SAβ-Gal表达显著。

　　●　与其他细胞老化标记相关的结果

　　●　流式细胞仪中，可以通过SPiDER-βGal荧光强度的变化来确认老化诱导的SAβ-Gal表达的增加。（右图）