细胞/细菌总RNA提取试剂盒

库存 ：大量

英文名 ：细胞/细菌总RNA提取试剂盒

保质期 ：室温保存

供应商 ：上海康朗生物科技有限公司

保存条件 ：2-8℃避光保存

规格 ：50次

细胞/细菌总RNA提取试剂盒

产品组分

货号	KL1061（50次）
溶液RD	30 ml
溶液RB	50 ml
溶液RP	30 ml
溶液RW	12 ml
TE	8 ml
DEPC处理水	10 ml
溶菌酶（50 mg/ml）	500 μl
RNase-free 纯化柱	50个
RNase-free 离心管	50个
说明书	1份

需要自备的溶液

●  β-巯基乙醇

●  无水乙醇

 

产品说明

细胞/细菌总RNA提取试剂盒是经过改进开发的新一代产品，提高了裂解液的裂解能力和提取的灵敏度，通过在特定适宜的条件下特异、可逆地结合RNA，彻底去除各种蛋白质和其他杂质，从而使得到的RNA纯度更好，质量更高。该试剂盒可从各种培养细胞或菌体中快速提取总RNA，每个吸附柱每次可处理50–100 mg组织或5×10⁶ 细胞，可同时处理大量不同的样品，一个小时内即可完成反应。提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等。

 

保存条件

溶菌酶和DEPC处理水-20℃保存，溶液RD、溶液RB和溶液RP 4℃保存，其他溶液和纯化柱室温保存。

 

注意事项

●  操作前在溶液RD中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%，如1 ml溶液RD中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的溶液RD 4℃可放置一个月，溶液RD在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。

●  第一次使用前应在溶液RW中加入无水乙醇，加入量为溶液RW：无水乙醇=1：4，即每12 ml溶液RW需要加入48 ml无水乙醇。

●  严防操作环境、使用的容器、耗材和试剂的RNase污染。操作过程中勤换手套。

●  使用本产品提取的RNA一般不含有DNA污染。在极少数情况下（与组织pH值等相关），如果有DNA污染而又必须去除，则可以用RNase-free的DNase处理样品。

●  请严格遵照操作步骤进行操作。

●  不同起始材料用量及预期RNA产率。

细胞种类	细胞最大用量	最大用量时RNA得率
COS	3×106	35 μg
Hela	7×106	15 μg
NIH/3T3	1×107	10 μg

 

操作步骤

操作前在溶液RD中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%。

第一次使用前应在溶液RW中加入无水乙醇，加入量请参考瓶上标签。

1.  收集细胞/菌体

● 悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：估计细胞数量，300×g离心5 min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。

● 单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10 cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。

● 菌体的收集（收集菌体数最大不超过1×10⁹）：4℃ 12,000 rpm离心2 min收集菌体，仔细去除所有培养基上清，用含有溶菌酶的100 μl TE彻底重悬菌体，孵育时间见下表。

细菌种类	TE缓冲液中溶菌酶的浓度	孵育时间（室温）
G-细菌	400 μg/ml	3-5 min
G+细菌	3 mg/ml	5-10 min

以下的所有离心步骤均在室温（20-25℃）进行。

2.  加入350 μl溶液RD（在使用前请加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀，若出现不溶性沉淀，12000 rpm离心2 min，将上清转移至另一离心管中。

3.  加入700 μl溶液RB，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入纯化柱（纯化柱+收集管）中，12,000 rpm离心30-60 s，倒掉废液，将纯化柱放回收集管中。

4.  向纯化柱中加入350 μl溶液RP，12,000 rpm离心30-60 s，弃废液，将纯化柱放回收集管中。

5.  向纯化柱中加入500 μl溶液RW（使用前请先检查是否已按1:4加入无水乙醇，即含80%乙醇），室温静置2 min，12,000 rpm离心30 s，弃废液，将纯化柱放回收集管中。

6.  重复上步操作。

7.  将纯化柱放回收集管中，12,000 rpm继续空离2 min，去除残余液体，将纯化柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

●  此步骤目的是将纯化柱中残余的漂洗液去除，离心后将纯化柱在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

8.  将纯化柱转入一个新的1.5 ml离心管（RNase-free）中，加30–100 μl RNase-free ddH₂O（DEPC处理水），室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min。

●  洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。

●  如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的溶液。