文献支持HBV 小鼠模型

提供商 ：维通达

服务名称 ：HBV 小鼠模型

规格 ：1 只

HBV 转基因小鼠 ，C57BL/6背景，高水平表达HBV病毒，为研究病毒和宿主因素影响HBV复制、发病基因和生理学过程提供了部分可能性；为控制HBV复制研究提供了稳定可遗传的小动物模型。
该模型可用于研究HBV、治疗药物和疫苗及更下游的慢性肝炎和纤维化（结合化学诱导）。

HBV 转基因小鼠具有以下显著优点：
1、生长繁殖正常，健康状态好；
2、小鼠外周血中人乙肝e抗原，乙肝表面抗原和外周血HBV病毒高拷贝；
3、稳定可遗传。

HBV 转基因小鼠主要应用领域：
1、高水平表达HBV病毒的小鼠模型为研究病毒和宿主因素影响HBV复制、发病基因和生理学过程提供了部分可能性；为控制HBV复制研究提供了稳定可遗传的小动物模型。
2、该模型可用于研究HBV、治疗药物和疫苗及更下游的慢性肝炎和纤维化（结合化学诱导）。 
                                                                                                                                                         
HBV 可以引起肝脏的急、慢性感染，其中慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。随着新的生物技术的涌现，如 CRISPR 基因编辑技术、RNAi 药物、小分子药物和靶向药物等潜在新药的涌现，急迫需要 HBV 药效测试的理想动物模型。灵长类动物、树鼩、鸭肝炎病毒和土拨鼠肝炎病毒等模型遗传背景不清，难以标准化，也使其应用受到限制^[1]。

本文对 HBV 感染、免疫病理学和治疗小鼠模型做一简单介绍，以方便研究者选择。    

HBV 小鼠模型优缺点对比

目前常用的 HBV 小鼠模型，可简单分为 5 类：

1、转基因小鼠

2、水动力注射模型

3、AAV 转染模型

4、人鼠嵌合肝脏小鼠模型

5、同时人源化免疫和肝脏小鼠模型

这 5 类模型各有优缺点，详见表 1 和图 1 介绍^[2,3]。

表 1   HBV 感染、免疫病理学和治疗小鼠模型简介

 

IS; immune system.

图 1   HBV 感染、免疫病理学和治疗小鼠模型简介

乙肝抗病毒药物筛选模型介绍

在乙肝抗病毒药物筛选方面，传统的方法是水动力和 AAV 相结合的模型。rAAV8-1.3HBV 经尾静脉注射到正常的 C57BL/6 小鼠体内，其表达水平随重组病毒注射剂量的增加而升高，高剂量注射时可造成超过 40% 的肝细胞感染 HBV， 血清中 HBV DNA 可达 10 的 5 次方以上。但要注意不同小鼠品系 HBV 感染的表型有差别。

而目前应用较多的是在乙肝抗病毒药物筛选方面应用较多的转基因小鼠模型，是 Guidotti 等^[4] 研发的，其在 HBV 全长序列 5'末端重复一个 C 基因和 X 基因及其增强子，构建了 1.3 倍全长 HBV 基因组的转基因小鼠，该小鼠体内可检测到 HBsAg、HBeAg 和 HBcAg，也可观察到小鼠体内完整病毒颗粒的形成，且病毒颗粒具有感染性，HBV 复制水平与慢性乙型肝炎患者相当。采用相似策略，北京维通达研发的 HBV 转基因小鼠模型，其外周血清中的 HBV DNA 拷贝数高达 10 的 8 次方 copies/ml；该小鼠体内可检测到较高水平 HBsAg、HBeAg 和 HBcAg 表达。

更精准的人源化肝脏模型

啮齿类最完备的 HBV 感染模型莫过于人鼠嵌合肝脏小鼠（人源化肝脏模型），因为在小鼠肝脏中定植的是人类的肝脏细胞，因而更好模拟了 HBV 自然感染和 cccDNA 复制过程。

目前，文献报道和商品化的有 5 种人源化肝脏小鼠模型：

1、uPA-SCID；

2、FRG；

3、TK-NOG；

4、AFC8；

5、URG[6～11，见表^[2]

其中 URG® 小鼠，是国内最早和唯一商品化的人源化肝脏小鼠模型。

URG® 小鼠简介及优势

URG® 小鼠由 4 种基因修饰动物模型交配获得，包含 2 个转基因和 2 个基因敲除。其核心模型源于 2006 年北京大学邓宏魁教授实验室，相关研究人员构建了 TRE-uPA 转基因小鼠和 Alb-rtTA 转基因小鼠，然后交配获得了 Alb-rtTA/TRE-uPA 双阳性小鼠；通过 Dox 诱导，在该小鼠中检测到了 uPA 表达和肝损伤[6]。

URG® 小鼠克服了世界上已有 uPA 小鼠的不足：新生小鼠死亡率高，繁殖困难；肝细胞移植手术需要在小鼠出生后二周内进行，技术难度大，死亡率高等缺点，而具有以下显著优点：

1、Tet-uPA 小鼠可正常生长，正常繁殖；

2、强力霉素（Dox）诱导肝损伤，诱导和肝细胞移植手术的窗口期可根据实验需要选定；

3、人源化肝脏小鼠重建的时间短，人肝细胞嵌合程度高。

人肝细胞移植后 4～6 周，人血清白蛋白（HSA）含量可以达到 3 mg/ml 以上（见图 1）。 

免疫组化和流式分析表明，小鼠肝脏中人源化程度可达 80% 以上。如图 2 所示，85% 的细胞人主要组织相容性复合物 I 类抗原 HLA-A,B,C 表达阳性。 

 

图 1. 人肝细胞移植后 4～6 周，HAS 含量可以达到 3mg/ml 以上

 

           

图 2. 高嵌合人源化肝脏小鼠，肝脏中 85% 的细胞 HLA-A,B,C 表达阳性

维通达自主研发了 URG® 小鼠模型，该模型借助 Tet-on 基因表达调控系统，可以通过强力霉素（Dox）诱导，在小鼠肝脏特异表达尿激酶（Urokinase plasminogen activator，uPA），引起小鼠肝脏损伤。是可调控的高效肝损伤模型。Tet-uPA 小鼠与免疫缺陷小鼠 Rag2null γcnull 或 NOD-scid γcnull 交配，获得免疫缺陷的诱导型肝损伤模型。这种小鼠通过移植人的肝脏细胞，可以获得真正意义上的人源化肝脏小鼠模型。 

维通达技术人员将 Alb-rtTA/TRE-uPA 双阳性小鼠连续 8 代回交到 NRG（NOD 背景的 Rag2null Il2rgnull 小鼠）背景，2012 年获得 Alb-rtTA/ TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull 小鼠。作为新一代的可调控肝损伤人源化肝脏小鼠模型，人源肝脏细胞可以实现 20～95% 整肝重建，可以满足 HBV 药效和药代及药动等相关实验。

表 2  人鼠嵌合肝脏小鼠（人源化肝脏模型）小结

合理的选择这些模型，将有助于加快药筛进程、验证新疗法和更快解决 HBV 生物学发病机制等方面的问题。如军事医学科学院疾病预防控制所宋宏彬（Song Hongbin）课题组，在细胞水平和动物模型体内，利用 CRISPR-Cas9 技术均实现了清除整合 HBV DNA，为根治 HBV 感染迈出了重要的一步^[12]。
 

参考文献
[1] HBV 感染小鼠模型的研究进展. 临床肝胆病杂志第 32 卷第 1 期 2016 年 1 月
[2] Modeling hepatitis B virus infection, immunopathology and therapy in mice.Antiviral Res. 2015 September ; 121: 1–8. doi:10.1016/j.antiviral.2015.06.012.
[3] Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection.Journal of Hepatology 2016 vol. 64 j S17–S31
[4] High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice. J. Virol. 1995, 69(10):6158.
[5] CRISPR/Cas9-mediated p53 and Pten dual mutation accelerates hepatocarcinogenesis in adult hepatitis B virus transgenic mice. Sci Rep. 2017 Jun 5;7(1):2796.
[6] A Mouse Model of Inducible Liver Injury Caused by Tet-On Regulated Urokinase for Studies of Hepatocyte Transplantation.The American Journal of Pathology.Volume 175, Issue 5, November 2009, Pages 1975-1983.
[7] Human hepatocytes with drug metabolic function induced from fibroblasts by lineage reprogramming. Cell Stem Cell, 14,394–403.
[8] Robust expansion of human hepatocytes in Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- mice. Nature biotechnology 25, 903-910, doi:10.1038/nbt1326 (2007).
[9] Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. The Journal of clinical investigation 120, 924-930, doi:10.1172/JCI40094 (2010).
[10] Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 352, 274-280, (2015).
[11] Successful Engraftment of Human Hepatocytes in uPA-SCID and FRG® KO Mice.Hepatocyte Transplantation pp 117-130.
[12] Removal of Integrated Hepatitis B Virus DNA Using CRISPR-Cas9. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:91.doi: 10.3389/fcimb.2017.00091