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猪瘟(csfv)病毒免疫荧光检测试剂盒使用说明书
【产品简介】
猪瘟病毒免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,单克隆抗体先与病毒反应,然后间接的与荧光抗鼠二抗反应,用这种荧光抗体检测细胞内的猪瘟病毒含量。
【产品内容】
试剂盒成分 | 数量 | 备注 |
csfv一抗工作液 | 11ml*1 | 4℃存放 |
浓缩荧光二抗 | 100ul*2 | -20℃存放 |
固定液 | 11ml*1 | 4℃存放 |
样品稀释液 | 45ml*3 | 4℃存放 |
盖板膜 | 2张 | - |
说明书 | 1份 | - |
【备用的器材】
长满单层的 ST细胞1瓶
排枪
排枪配套使用的枪头
加样槽
离心管
96孔细胞培养板两块 ST细胞
【试剂配置】
6%MEM培养基:MEM培养基+6%猪瘟专用血清
2%MEM培养基:MEM培养基+2%猪瘟专用血清
荧光二抗工作液:将浓缩荧光二抗按照1:50稀释(用样品稀释液稀释50倍,现用现配)
【操作步骤】
用6%MEM培养基将st细胞铺96孔板一个(细胞密度为3*105/ml),次日弃上清接毒。
接毒步骤如下:
- 无血清培养基将病毒液作连续10倍的稀释,从100-10-8。
- 将稀释好的病毒接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种100微升。
- 放置于37℃吸附1小时后,补入2%MEM培养基每孔100ul,置于37℃CO2培养箱培养。
- 设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排。
- 逐日观察,一般需要观察120小时即可测定荧光。
1.弃掉96孔细胞培养板上清,每孔加入150微升样品稀释液,静置30秒,甩去孔内液体,重复洗3次,吸干水分,不用拍板。
2. 每孔加入50微升-20℃的固定液放入-20℃静置20分钟,弃掉上清,不用拍板。
3.同上(第一步)重复洗涤3次,吸干水分,不用拍板。
4. 每孔加入一抗工作液50ul,盖上盖板膜,放置于37℃40分钟后,同上(第一步)重复洗涤3次,吸干水分,不用拍板。
5. 每孔加入荧光二抗工作液50ul,盖上盖板膜,放置于37℃40分钟后,同上(第一步)重复洗涤3次,吸干水分,不用拍板。
6. 观察荧光显微镜并根据下表记录不同稀释度的荧光孔数,之后根据10-1~10-8计算出病毒的TCID50含量。
例:
csfv病毒液稀释度 | 出现荧光的孔数 | 出现荧光孔的比率 |
100 | 8 | 8/8=1 |
10-1 | 8 | 8/8=1 |
10-2 | 8 | 8/8=1 |
10-3 | 7 | 7/8=0.875 |
10-4 | 3 | 3/8=0.375 |
10-5 | 1 | 1/8=0.125 |
10-6 | 0 | 0/8=0 |
10-7 | 0 | 0/8=0 |
10-8 | 0 | 0/8=0 |
LgTCID50=l-d(s-0.5)
L:最高稀释度的对数
D:稀释度对数之间的差
S:阳性孔比率总和
LgTCID50=l-d(s-0.5) =-1-1*(3.375-0.5)=-3.875
TCID50=10-3.875/ml
即:将该病毒稀释10-3.875接种100ul可使50%的细胞发生病变。
【注意事项】
(1)切记做不接毒的空白细胞对照。
(2)样稀清洗与加样时要温柔,并从同一个位点加入。
(3)加样槽用前请用一次性塑料手套套住,加不同溶液时更换手套,防止不同溶液的交叉污染。
(4)配制好的荧光二抗避光保存,现配现用,固定液放-20℃ 1h后再使用。
(5)操作过程中的移液、计时和洗涤必须精确,以免影响结果。
(6)被测病毒-20化开后需要及时接毒,不可放置室温;配置好的培养放4℃于30天内使用。
(7)如果不需要TCID50数值,请根据100~10-8直接观察荧光显微镜即可。
【贮藏与有效期】
低温避光保存,有效期为12个月。
【产品规格】2*96T
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