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文献和实验
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库存 :68
英文名 :Y187 Chemically Competent Cell
保质期 :12个月
供应商 :江西江蓝纯生物试剂有限公司
保存条件 :避光保存
规格 :10×100ul/50×100ul
Y187酵母感受态细胞Y187 Chemically Competent Cell
产品货号: JLC-G043
保存条件: -80℃
产品规格:10×100μl 50×100μl
产品介绍:
基因型 :
MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1
简单说明 :
Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂,双杂实验用菌株,MATα型,可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株(Y2HGold,AH109等)通过mating操作进行筛库试验。
Transformation marker为: trp1, leu2,报告基因为:lacZ, MEL1。Y187 -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒PGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。
正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成bait 融合蛋白(bait -BD)和 prey 融合蛋白(prey-AD),如果 bait 和 prey发生相互作用,就会促使 BD 和 AD 的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。Y187有两个报告基因:lacZ, MEL1,分别由两种不同的启动子(G1,M1)启动,这两种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。 High5TM系列Y187感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。
操作说明 :
1. 取100 µl冰上融化的Y187酵母感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴,重复一次) 10 µl,PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。
4. ddH2O 50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h。
Preparation of Media:
YPDA (1L):
Tryptone 20g
yeast extract 10g
0.2% adenine 15ml
补水到 950ml, 用盐酸调PH到 6.5
Agar 20g (for plates only)
121度,15分钟高压灭菌,待培养基温度降到55度时,加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine 2g补水到1L,溶解后高压灭菌或0.22um滤膜过滤除菌
注意事项 :
1. 感受态细胞在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y187酵母感受态细胞酵母菌株对高温敏感,适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。
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