NMY51酵母感受态细胞

NMY51酵母感受态细胞

价格: ¥240 - 1020

品牌:geltinsa

货号: JLC-G041

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库存 :51

英文名 :NMY51 Chemically Competent Cell

保质期 :1年

供应商 :上海机纯实业有限公司

保存条件 :低温保存

规格 :10×100ul/50×100ul

NMY51酵母感受态细胞
NMY51 Chemically Competent Cell

产品货号: JLC-G041                

保存条件: -80℃   

产品规格 :  10×100μl  50×100μl

产品介绍 :  

基因型 :  

MATahis3200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZade2::(lexAop) 8-ADE2 GAL4

简单说明 : 

DUALmembrane系统是DUALsystems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术,它利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用,是目前市面上检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用 NMY51酵母菌株,可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验;此菌株Transformation  marker为:  trp1, leu2-3,

报告基因为:HIS3, ADE2 和lacZ,步通过营养缺陷型报告基因(HIS3, ADE2)进行选择性生长筛选,进一步通过 LacZ 报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选,三个独立的报告基因,受不同启动子的调控,降低假阳性几率。原理:泛素(ubiquitin)分子量很小,由 76aa 残基组成;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的 N 端,然后被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分:N 端(Nub),C 端(Cub)。

首先,人为地将泛素 Nub 的 3 位异亮氨酸突变为甘氨酸(NubI 突变为NubG)。这样与 Cub 的亲合力大大降低,避免了 Cub 和 Nub 自我结合或接近的可能性。其次,将Cub 部分与人工合成的 LexA-VP16 转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合,UBPs 也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成 bait 融合蛋(bait-cub-LexA -VP16)和 prey 融合蛋白(prey-NubG)。如果 bait 和 prey发生相互作用,就会促使 NubG 和 Cub 的相互接近,被 UBPs 识别,导致 LexA-VP16 的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。 

此系统可使用四种Bait质粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE,pBT3-C,筛选标志均为LEU;三种Prey质粒:pPR3-C ,pPR3-SUC,pPR3-STE,筛选标志均为TRP。 High5TM系列NMY51感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。

操作说明 : 

1. 取100 µl冰上融化的NMY51感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴,重复一次) 10 µl,PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。 

2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。 

3. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。 

4. ddH2O 50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h。 

Preparation of Media:
YPDA (1L):

Tryptone                                      20g
yeast extract                                10g 
0.2% adenine                               15ml
补水到 950ml,  用盐酸调PH到      6.5
Agar                  20g (for plates only)
121度,15分钟高压灭菌,待培养基温度降到55度时,加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g补水到1L,溶解后高压灭菌或0.22um滤膜过滤除菌

注意事项 : 

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. NMY51酵母菌株对高温敏感,适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。
 

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