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库存 :88
英文名 :5′-RACE Kit
保质期 :一年
供应商 :北京百奥莱博科技有限公司
保存条件 :低温运输、-20℃
规格 :10次
特别提示:包括5′RACE试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:5′RACE试剂盒
英文名称:5′-RACE Kit
产品货号:BTN101105
产品规格:10次
研究真核基因的zuì基础的工作之一就是确定其转录终止位点,目前zuì通用的方法是5′-RACE法,RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术,它在不建立cDNA文库的前提下,利用已知cDNA序列设计引物,通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发。RACE的原理如下图:
产品特点:
1. 即开即用,客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化,包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。
试剂盒组成:
成分 | 规格 |
MMLV逆转录酶-RI混合液(RNase H-,200U/μL) | 10μl |
MMLV Buffer-dNTP混合液 | 60μl |
微量核酸沉淀剂 | 400μl |
TdT(末端转移酶) | 10μl |
2×TdT Buffer(含dATP) | 100μl |
PCR MagicMix 3.0 | 1.5ml |
5′-RACE引物A-引物B混合液 | 100μl |
5′-RACE引物C | 100μl |
RNase-Free水 | 1ml |
储存条件:低温运输、-20℃保存、有效期一年。
使用方法:
1.变性模板RNA:将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中,补RNase-Free水到9μL,65℃保温5分钟后短暂离心,立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低,体积超过9μl,可以使用本公司的核酸浓缩剂(需另购,产品编号为BTN110801)浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应(用户可以根据需要设阴性对照):在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中,按顺序加入:
成分 | 用量 |
自备的基因专一性引物A(10μM) | 4μl |
MMLV Buffer-dNTP混合液 | 6μl |
MMLV逆转录酶-RI混合液 | 1μl |
合计 | 20μl |
3. 37℃保温60分钟,42℃保温30分钟,50℃保温10分钟,zuì后75℃保温10分钟使逆转录酶变性。
4. 短暂离心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀剂(本产品含不溶的核酸助沉剂,用前需要充分摇匀再取用),震荡混匀。
6.室温12000rpm离心15分钟,小心吸弃上清。
7. 加入1mL自备75%乙醇,室温12000rpm离心5分钟,小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒,小心吸弃残留液体后,稍微晾干后加入10μL RNase-free水,充分吹打溶解,得到cDNA溶液。注意:为保证加尾效率,溶解cDNA的RNase-free水zuì好不要超过10μl。
9. 加尾反应:在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶,轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应,然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 第一轮PCR:用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应(样品组zuì好设用量梯度,单位:μL)。
成分 | 梯度1 | 梯度2 | 梯度3 | 梯度4 |
PCR MagicMix 3.0 | 25 | 25 | 25 | 25 |
自备基因专一性引物B(10μM) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
5′RACE引物 A-引物B混合液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
稀释后的加尾反应液 | 1 | 5 | 10 | 15 |
RNase-free 水 | 19 | 15 | 10 | 5 |
合计 | 50 | 50 | 50 | 50 |
13. 按下列条件进行 PCR(注:应根据实际情况选择适当的退火温度)。
第1次循环:94℃ 5分,48-52℃ 2分,72℃ 4分
第2-30次循环:94℃ 40秒,52-60℃ 1分,72℃ 3分
zuì后延伸:72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果,如果一条清晰的条带,则可以不做后续的第二轮PCR,而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR:如果第一轮PCR没有一条清晰的条,则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释,然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板:
成分 | 用量 |
第一轮 PCR产物的稀释液 | 1μl |
PCR MagicMix 3.0 | 25μl |
5′RACE引物 C | 2.5μl |
自备基因专一性引物 C(10μm) | 2.5μl |
RNase-free 水 | 补水至50μl |
合计 | 50μl |
16. 按下列条件进行 PCR:第 1-30次循环(94℃ 40秒,52-60℃ 1 分,72℃ 3分),zuì后延伸:72℃ 15分
17. 取10-20μL第二轮 PCR产物进行琼脂糖电泳,一般都会有一个样品有清晰的条带出现,则可以直接进行DNA测序或TA克隆。
我公司销售的5′RACE试剂盒北京厂家,质量上佳,价格普惠,欢迎广大新老客户踊跃订购。
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