Calcein-AM/PI Double Stain Kit Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒

供应商 ：上海代轩生物科技有限公司

保存条件 ：-20℃

规格 ：500T

产品描述:
Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。
由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞
使用方法:
1. 工作液的配制
1.1 1×Assay Buffer（反应缓冲液）的配制
从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。
1.2 1×染色工作液的配制
1）先将低温保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室温20-30 min。
注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。 
2）取5 µL Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µL PI溶液（1.5 mM）加入5 mL 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2 μM，PI的工作液浓度为4.5 μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最佳的荧光结果。
注意：由于Calcein-AM的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
2. 染色步骤
2.1  对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3 min）。
对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3 min）收集细胞。
2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。
2.3  用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×105~1×106细胞/mL。
2.4  取100 µL染色工作液加入200 µL细胞悬液内，混匀，37℃孵育15 min。
注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。
2.5  荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545 nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。
a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%Digoxin孵育细胞10 min，或者用70%乙醇孵育细胞30 min，从而制备死细胞；
b）用0.1-10 µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
c）用0.1-10 µM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。
注意事项
1）由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。
2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。
3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。