蛋白质组

       高通量蛋白质组分析，也称为鸟枪法质谱分析（shotgun），是对遗传背景类似的2个或多个样本之间、在全蛋白质组层面上开展蛋白质表达水平的质谱定量分析方法。根据是否引入对蛋白或多肽的标记与否，可分为基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学分析，包括iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学、SILAC标记定量蛋白质组学、二甲基标记定量蛋白质组学，以及不依赖于标记技术的非标（Label-free）定量蛋白质组学。蛋白质是生物表型和疾病发生的直接功能分子。因此在全蛋白质组层面上开展高通量定量蛋白质表达谱分析对于揭示各种生物学现象和疾病发生、发展机理不仅有着重要的理论意义，对于以蛋白质生物标志物的鉴定、蛋白质药物靶点的筛选也有着重大的现实意义。

       人体细胞中估计蛋白总数约为18,000~20,000个。传统的基于2D双向电泳分离的蛋白质组通常可以鉴定出约1,000种蛋白，常规的基于酶解多肽的shutgun蛋白质组学分析方法约能鉴定3,000～4,000个蛋白，对全蛋白质组的覆盖仅在5~20%左右，远远不能满足高通量定量蛋白质表达谱分析的要求。结合超高分辨率、高灵敏度的液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）、精细的样品制备与蛋白分离方法，凌恩生物在细胞与组织类样品中可鉴定直至超过10,000个蛋白,全蛋白质组的覆盖>60%，结合高级生物信息学分析，构建高通量定量蛋白质表达谱乃至物种的蛋白质组草图，从而引领进入“蛋白质学时代”。

非标(Label-free)蛋白质组定量技术是一种不依赖于同位素标记的新型蛋白质定量技术，该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，无需昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样本中相应肽段的信号强度，就能对相应的蛋白质进行相对定量。

技术原理    

现有基于质谱的非标记定量技术主要有两种：

1、依据一级质谱相关的肽段峰强度(peak intensity)和峰面积(peak area)等信息进行蛋白定量，

2、依据蛋白质对应肽段的二级质谱总数(spectral counts)进行定量。

 

技术流程

仪器设备

Thermo Scientific Q Exactive

 

技术优势    

无需昂贵的同位素标记试剂，实验耗费低；    

对样本的操作少，从而使其更接近原始状态；      

不受样本条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。

 

应用领域  

疾病标志物筛选      

作用机制研究  

药物作用靶点研究        

特殊功能蛋白质筛    

植物抗逆研究

样品要求

样品类型	样品要求（/组样品）
蛋白质提取物	浓度 >1μg/μl，蛋白质总量 >200μg
细胞样品	细胞量>107
组织样品	动物、微生物组织湿重>10mg；植物鲜嫩组织>100mg
体液样品	血液体积>500μl

 

iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术。这两种技术采用2-10种稳定同位素标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量。

 

技术原理

iTRAQ/TMT试剂由三部分组成：报告基团、平衡基团和反应基团。反应基团形成2-10种等质量同位素标签。iTRAQ/TMT试剂标记酶解后的肽段，可与氨基酸N端及侧链的伯胺基团发生反应。在一级谱图中，来自于不同样本的同一肽段，标记后表现为相同的质荷比。在二级谱图中，报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂，带不同同位素标签的同一肽段产生质量不同的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样本间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。其基本原理与技术流程如下图所示：

 

 

仪器设备

Thermo Scientific Q Exactive              

AB Sciex TripleTOFTM 5600

 

技术优势

1通量高

可以同时进行8个样品(iTRAQ)或10个样品(TMT)的分离鉴定和定量，提高了实验通量，可以进行多个时间点蛋白质组的动态监测

 

2重复性好

来源不同的样品可以同时进行色谱分离和质谱鉴定，大大增强实验的重复性，最低可以检测到不同样品间5%的蛋白差异变化

 

3分辨率高、定量准确

AB SCIEX公司的TripleTOF 5600系统和Thermo公司的Q-Exactive系统是世界上极少数具有准确质量数与高分辨率进行同时定量和定性分析的LC-MSMS系统。先进的仪器再配上iTRAQ试剂和TMT试剂本身基于报告离子的定量原理和高达99%的蛋白标记效率，使得鉴定到的蛋白数量更多，同时也保证了结果的可靠性.

 

4鉴定结果可靠、蛋白检测范围广

二级质谱可以产生很好的y、b离子系列，蛋白序列覆盖率提高，鉴定结果更可靠，同时一个蛋白质有多个肽段被鉴定，进一步提高了定量的准确性。此外，iTRAQ和TMT实验在肽段水平进行蛋白分离和鉴定，大大提高膜蛋白等难溶性蛋白的溶解性，扩大蛋白检测范围

 

应用领域

疾病标志物筛选                              

作用机制研究

植物抗逆研究                      

药物作用靶点研究

特殊功能蛋白质筛选

 

样品要求

样品类型	样品要求（/组样品）
蛋白质提取物	浓度 >1μg/μl，蛋白质总量 >300μg
细胞样品	细胞量>107
组织样品	动物、微生物组织湿重>10mg；植物鲜嫩组织>100mg
体液样品	血液体积>500μl