动物组织总RNA提取试剂盒

库存 ：213

英文名 ：Total RNA Extraction Kit from Animal tissue

保质期 ：9个月

供应商 ：北京百奥莱博科技有限公司

保存条件 ：RT(15-25℃)

规格 ：50次

本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从动物组织中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。30-40分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他杂质污染。

产品特点：
·针对动物组织独特配置，操作更简单、流程更优化。
·配有高效的DNaseⅠ，可有效去除DNA污染。
· RNA纯度更高，无杂质残留，特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
·操作安全可靠，无需酚/氯仿抽提，无需氯化铯梯度离心，无需氯化锂或乙醇沉淀。

下游应用：
· RT-PCR
· Northern blot、Dot blot
· Real-time RT-PCR
·芯片分析
· polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆

提取实例：

本试剂盒分别提取大鼠不同组织的总RNA。提取后洗脱体积100μl，RNA上样量2～4μl，1%琼脂糖凝胶，6V/cm电泳30min。
Lane 1～2：胚胎（13天)
Lane 3：肾脏
Lane 4～6：肝脏
Lane 7：脾
Lane 8：胸腺
Lane 9：肺


大鼠不同组织RNA提取得率

试剂盒组成：

组分	50T
裂解液RL	30ml
去蛋白液RW	140ml
漂洗液RW	12ml
Proteinase K	500μl
研磨杵	10个
RNase-Free ddH2O（瓶装)	40ml
RNase-Free吸附柱CR3（含2ml收集管)50套
DNaseI	1500U
缓冲液RDD	4ml
RNase-Free ddH2O（管装)	1ml
RNase-Free离心管（1.5ml)	50个

储存条件：室温（15-25℃)保存。RNase-Free DNase I,缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O（管装)置于2-8℃保存；加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。）

使用前注意事项：
1．操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1ml RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RL 4℃可放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
2．第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
3．以下操作如非指明，均在室温下进行。

DNase I储存液的配制：
将DNase I干粉（1500U）溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。

操作步骤：
1．匀浆处理：
  每10-20mg组织加300 μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用研磨杵将组织彻底研磨（如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器）；随后向匀浆液中加入590 μl RNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20 min。
  注意：组织量一定不要超过20mg，否则将导致RNA得率和质量下降。
2．12000rpm（~13400×g)离心2-5 min，取上清进行以下操作。
3．缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
4．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
5．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
6．向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
7．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
8．向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9．重复步骤8。
10．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
11.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

RNA纯度及浓度检测：
完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15 min)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。28S rRNA的量约为18S rRNA的两倍，说明RNA的完整性较好。
纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH2O稀释n倍，用RNase-Free ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀,OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
  终浓度（ng/μl）= （OD₂₆₀)×（稀释倍数n)×40