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文献和实验
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保存条件 :2-8℃
保质期 :6个月
英文名 :Glucose Dehydrogenase(GCDH) Activity Assay Kit
库存 :100
供应商 :北京索莱宝科技有限公司
CAS号 :BC2695-100T/96S
规格 :100管/96样
葡萄糖脱氢酶(GCDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
货号:BC2695
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体100 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
- 试剂二:临用前加入7.5 mL试剂一溶解,用不完的试剂2-8℃保存8周;
- 试剂三:临用前每瓶加入5 mL试剂一溶解,用不完的试剂建议分装后-20℃避光可保存4周;
- 工作液的配制:按照试剂一:试剂二:试剂三为4:3:2的体积比例充分混匀,现用现配,用前37℃预热10 min。
GCDH(EC 1.1.1.47)催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H,主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。GCDH是一种制备高含量低聚果糖的理想用酶,同时也是临床血糖测定的诊断用酶,可广泛用于食品工业及医药工业领域中。
GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH,利用NADH在340nm处吸光值的变化即可反映葡萄糖脱氢酶的活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:具体操作步骤详见“产品资料”附件
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心10 min,取上清置于冰上待测。
细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(104个)︰提取液体积(mL)为500~1000︰1的比例(建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率200 W,超声3s,间隔7s,总时间5min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
血清(浆):直接检测。
二、测定步骤
- 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
- 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂:
试剂名称(µL) | 空白管 | 测定管 |
工作液 | 180 | 180 |
蒸馏水 | 20 | - |
样本 | - | 20 |
加入工作液即开始计时,立即混匀,于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃水浴或培养箱1min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃),拿出迅速擦干测定1min 10s时的吸光值A2,计算ΔA测定管=A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管(空白管只需做1-2次)。 |
- GCDH酶活计算
- 按样本蛋白浓度计算
GCDH酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
GCDH酶活(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T =1607.7×ΔA÷W
- 按细胞或细胞数量计算
GCDH酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T
=1607.7×ΔA÷细胞数量(万个)
- 按液体体积计算
GCDH酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=1607.7×ΔA
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/ mol /cm;d:比色皿光径,1cm;109:单位换算系数,1mol=109nmol;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V样:反应体系中样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,1min。
B、按96孔UV板计算:
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
注意事项:
- 样本提取上清液置于冰上待测,且样本提取完成后建议当天提取当天内测完。
- 当A1或A2大于1.7时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
- 当ΔA大于1.5时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
- 取0.1g肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.5806-0.5291=0.0515,ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0294-0.0294=0,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0515-0=0.0515,按样本质量计算酶活得:GCDH酶活(U/g质量)=1607.7×ΔA÷W =1607.7×0.0515÷0.1=827.966U/g 质量。
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