慢病毒构建稳转细胞系

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提供商：枢密科技

服务名称：慢病毒构建稳转细胞系

定义
稳转细胞系（稳定表达细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后，通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细胞中经细胞克隆挑选得到的，由一个细胞扩增得到的细胞株。单克隆细胞株性状统一，传代过程中细胞的基因表达保持稳定。

枢密科技慢病毒采用三质粒系统转染293T细胞包装慢病毒颗粒，将Gag/Pol和载体分开，并且使用VSV-G的膜蛋白，包装出来的慢病毒宿主范围广，是基因转导的理想工具。

科研和临床应用
在基因劝能的研究中，稳定表达细胞株弥补了在一些功自B实验中瞬时感染（或转染）由于外源基因表达时间短的缺陷，便于长期观察基因对于细胞功能的影响以及蛋白质间相互作用。

服务流程
基因/模板DNA合成+载体构建+慢病毒包装+收获病毒液+q-PCR检测病毒滴度测定+慢病毒稳转细胞株筛选=稳转细胞株
单克隆细胞系筛选

对感染并筛选后的细胞进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆,再进行扩大培养，以获得性状单一，表达稳定的细胞株。
   1.将细胞消化后接种于96孔板中，接种的细胞密度为1个孔；
   2标记出具有单个细胞的孔，将Puromycin浓度减至维持浓度(筛选浓度的1/2-14)，继续筛选和扩增；
   3.扩增完毕后，收集细胞进行qPCR或Westem Blo鉴定，选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种。

混合克隆细胞系筛选
将Puromycin浓度减至维持浓度(筛选浓度的1/2-1/4)，继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，同时收集细胞进行qPCR或Westem Blol鉴定(鉴定目的基因表达水平)，并将鉴定结果正常的细胞冻存保种。

最终交付
慢病毒病毒滴度检测报告；稳转细胞株；实验报告，包括实验流程、测序结果和峰图、引物序列、载体图谱和滴度测定报告和q-PCR稳转株的检测等。