DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒

库存 ：371

英文名 ：DNA/RNA/Protein Isolation Kit

保质期 ：一年

供应商 ：北京百奥莱博科技有限公司

保存条件 ：RT

规格 ：50次

特别提示：包括DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒
英文名称：DNA/RNA/Protein Isolation Kit
产品货号：WH0056
产品规格：50次

本试剂盒可从培养的动物细胞或者组织中快速同步提取DNA、总RNA和总蛋白，可同时处理大量不同样品。1小时左右可完成反应。可用于PCR、RT-PCR和蛋白检测等多种分子生物学下游实验。

产品应用：
·方便：从同一样本中同时得到DNA、RNA和总蛋白。
·快速：1h左右可完成一次抽提。
·安全：提取过程无需酚氯仿有机物。

试剂盒组成：

组分	50T
裂解液RL	30ml
去蛋白液RW1	40ml
漂洗液RW	12ml
RNase-Free ddH2O	15ml
RNase-Free吸附柱CR3（含2ml收集管)	50套
吸附柱CB3	50个
缓冲液GD	13ml
漂洗液PW	15ml
洗脱缓冲液TB	15ml
RNase-Free离心管（1.5ml)	100个
RNase-Free离心管（2ml)	50个
RNase-Free收集管（2ml)	50个
蛋白沉淀剂PR	220ml
蛋白溶解缓冲液SP	15ml

储存条件：室温保存一年，加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月。

选配试剂：DNaseI （目录号：WH0051)

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。）

使用前注意事项：
1．操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%，如1ml RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液zuì好现用现配。配好的RL 4℃可放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热至56℃溶解并平衡至室温后使用。
2．第一次使用前应在漂洗液RW、PW和缓冲液GD中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
3．以下操作如非指明，均在室温下进行。
4．对于某些敏感的RNA应用实验可能需要完全去除DNA，可以参照DNase I消化流程在柱上进行。

操作步骤：
一、从培养细胞中同时提取DNA和总RNA
1．收集细胞：
悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：估计细胞数量，300×g离心5 min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。
单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。）
1）直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第2步裂解步骤。
2）胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至1.5 ml RNase-Free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
  注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，造成RNA的产量降低。
2．裂解处理：
对于离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），旋涡震荡30 sec。

沉淀细胞数量	裂解液RL
＜5×106	350μl
5×106-1×107	600μl

对于直接裂解的细胞：RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），将细胞裂解液转移至离心管中，涡旋震荡30 sec。

容器直径	裂解液RL
＜6cm	350μl
6～10cm	600μl

3．将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3 （吸附柱CB3放在2 ml RNase-Free离心管中)，12000rpm （~13400×g)离心30-60 sec，收集滤液。将吸附柱CB3放在收集管中室温或4℃放置至后续提取DNA。

总RNA提取：
4．向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350 μl或600 μl），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中（RNase-Free吸附柱CR3放入离心管（此管自备)中），12000rpm（~13400×g )离心30-60 sec，保留离心管中的液体（用于沉淀蛋白），将RNase-Free吸附柱CR3放入收集管中。
  注意：配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
5．向RNase-Free吸附柱CR3中加入700 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
6．向RNase-Free吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
7．重复步骤6。
8．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将RNase-Free吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
9．将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5 ml RNase-Free离心管中，加入100 μl RNase-Free ddH2O室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

基因组DNA提取：
10．向DNA吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD （使用前请先检查是否已加入乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
11．向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
12．重复步骤11。
13．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CB3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
14．将吸附柱CB3转入一个新的1.5 ml RNase-Free离心管中，加入100 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到DNA溶液。

蛋白质提取流程见说明zuì下方。

二、从动物组织中同步提取DNA和总RNA
1．匀浆处理：
切割小块组织加入适量裂解液RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用电动或玻璃匀浆器将组织彻底研磨。旋涡震荡30 sec。

起始组织量	裂解液RL
10～20mg	350μl
≥ 20mg	600μl

2．12000rpm（~13400×g)离心3-5 min，小心吸取上清至DNA吸附柱CB3 （吸附柱CB3放在2 ml RNase-Free离心管中)，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，收集滤液。将吸附柱CB3放在收集管中室温或4℃放置至后续提取DNA。

总RNA提取：
3．向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350 μl或600 μl），混匀（此时可能会出现沉淀）。
  注意：配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。
4．得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中（RNase-Free吸附柱CR3放入2 ml RNase-Free离心管中），12000rpm（~13400×g )离心30-60 sec，保留离心管中的液体（用于沉淀蛋白），将RNase-Free吸附柱CR3放入收集管中。
  注意：将溶液和沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
5．向RNase-Free吸附柱CR3中加入700 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
6．向RNase-Free吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
7．重复步骤6。
8．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将RNase-Free吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
9．将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5 ml RNase-Free离心管中，加入100 μl RNase-Free ddH2O室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

基因组DNA提取：
10．向DNA吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD （使用前请先检查是否已加入乙醇），12000rpm （~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
11．向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
12．重复步骤11。
13．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CB3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
14．将吸附柱CB3转入一个新的1.5 ml RNase-Free离心管中，加入100 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到DNA溶液。

DNase I消化流程（可选）：
DNase I储存液的配制：将DNase I干粉（1500U）溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
  注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。
1．按照总RNA提取流程1－4步进行提取。
2．向RNase-Free吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
3．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的1.5 ml RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
4．向RNase-Free吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
5．向RNase-Free吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
6．按照RNA提取流程6-9步进行提取。

蛋白质提取：
1．将提取完RNA的流出液中加入四倍体积的冷bǐng酮（客户自备）或蛋白沉淀剂PR，充分混匀，冰上或-20℃放置10-30 min。（请根据体积选择相应的离心管，离心管客户自备）。
  注意：bǐng酮沉淀后的蛋白比PR沉淀的蛋白难溶解，但是沉淀的蛋白量较多，可根据试验的需要来选择。
2．12000rpm，4℃，离心10min，弃上清。
3．加入100 μl冰冷的95%乙醇于沉淀中，4℃，zuì大转速离心1 min，用移液器吸出上清，尽可能去除上清。
4．室温干燥沉淀。
  注意：干燥不彻底也许会由于乙醇的残留导致蛋白上样出现问题，过分干燥会使蛋白沉淀比较难溶。
5．加入100 μl或适量的蛋白溶解缓冲液SP（采用缓冲液SP溶解之后的蛋白样品适用于SDSPAGE及Westernblot试验,但不适合采用Bradford方法进行蛋白定量,如需采用Bradford方法进行蛋白定量可采用5%SDS溶解蛋白,亦可根据下游的试验选择适合的蛋白溶解缓冲液），加入的蛋白缓冲液的体积根据初始样本量及下游试验要求来确定。

蛋白样品如需进行SDS-PAGE电泳可进行如下操作：
6．样品中加入蛋白loading buffer，95℃变性5-10min，然后冷却样品至室温。
7．zuì大转速离心1 min,沉淀残余的未溶解物质，吸取上清进行下游的试验如SDS-PAGE和Western Blot等。溶解的蛋白可以-20℃保存数月或者4℃数天。

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