文献支持土壤中性磷酸酶测试盒 （NP） 可见分光光度法

土壤中性磷酸酶（S-NP）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0460
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
试剂一	液体21 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体11 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂四	粉剂×2支	2-8℃保存
标准品	液体1 mL×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入50mL蒸馏水充分溶解，2-8℃保存8周；
2. 试剂四：临用前取1支加入576μL无水乙醇（自备），24μL蒸馏水充分溶解。试剂变褐色后不能再使用，2-8℃可保存2周；
3. 标准品：0.5μmol/mL苯酚标准液。

产品说明：
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。

中性环境中，S-NP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-NP活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水、乙醇、30~50目筛和甲苯（不允许快递）。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比可以例参考文献）
1. 新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30~50目筛。
2．称取风干混匀土壤约0.1g，加入0.05mL甲苯（自备），轻摇15min；然后再加入0.4mL试剂一并且充分摇匀，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后取出并迅速加入1mL试剂二，充分混匀，以终止酶催化的反应。10000rpm，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。
2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL试剂一，200μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加730μL蒸馏水，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A空白管。
3. 标准管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL标准液，200μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加730μL蒸馏水，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A标准管。

注：空白管和标准管只需测定1-2次。

1. 测定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL上清液，200μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加730μL蒸馏水，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A测定管。

三、S-NP活性计算
活性单位定义：37℃中每克土壤每天释放1nmol酚为1个酶活单位。
S-NP活性（U/g 土样）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)] ×1000×V总÷W÷T
=725×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准液：0.5μmol/mL；V总：催化体系总体积，1.45mL；W：土壤样本质量，g；T：催化反应时间，24h=1d；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol。
注意事项：
测定期间请将样本在冰上放置，以免酶变性或失活。
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