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规格 :1ml
介绍:RNAFit是一种功能强大的siRNA / miRNA转染试剂,可确保在哺乳动物细胞中进行有效的转染和基因沉默,并且具有高重复性的结果。在绝大多数的细胞(如HeLa,MCF7或NIH-3T3)中使用RNAFit转染1 nM siRNA,就能达到超过90%的转染效率;对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞,使用RNAFit转染终浓度为5 nM的siRNA,也可以观察到超过80%的转染效率。1贴壁细胞转染siRNA操作步骤
1.1接种细胞
为了使用RNAFit转染贴壁细胞取得最佳的转染效果,需要提前一天将细胞接种到相应的培养板中,以转染时细胞汇合度达到30-50%为宜。(推荐接的细胞数量参见表1)
培养板规格 | 接种细胞数量 | 每孔表面积 | 培养基体积 |
96-well | 5 000 ± 2 500 | 0.3cm2 | 0.2 ml |
24-well | 25 000 ± 10 000 | 1.9 cm2 | 1 ml |
12-well | 50 000 ± 20 000 | 3.8 cm2 | 2 ml |
6-well / 3.5 cm | 150 000 ± 50 000 | 9.4 cm2 | 4 ml |
6 cm 培养皿/25cm2培养瓶 | 400000 ± 100000 | 25 - 28 cm2 | 8 ml |
10 cm培养皿 / 75 cm2培养瓶 | 1 x 106 ± 250 000 | 75 - 78.5 cm2 | 15 ml |
14 cm培养皿 / 175 cm2培养瓶 | 2 x 106 - 5 x 106 | 153 - 175 cm2 | 20 ml |
表1.转染前一天推荐接种的细胞数
1.2 贴壁细胞转染
为了达到高的基因沉默效率,我们建议siRNA浓度范围为1 nM至10 nM,因为最佳siRNA浓度和靶基因本身、细胞类型、siRNA效力、靶mRNA的半衰期等有很大关系。需要注意的是,在较低的siRNA浓度下,脱靶率通常最低。 RNAFit的用量应根据siRNA浓度和培养皿规格进行调整,见表2。
培养板规格 |
siRNA(pmoles)/孔 |
siRNA(ng)/孔 |
RNAFit 体积 |
无血清培养基体积 |
完全培养基体积 |
总体积 |
96-well | 0.17 | 2.4 ng | 0.75 ± 0.5 µl | 50 µl | 125 µl | 175 µl |
24-well | 0.6 | 8.4 ng | 2 ± 1 µl | 100 µl | 500 µl | 600 µl |
12-well | 1.2 | 17 ng | 4 ± 2 µl | 200 µl | 1 ml | 1.2 ml |
6-well /3.5 cm | 2.2 | 31 ng | 8 ± 4 µl | 200 µl | 2 ml | 2.2 ml |
6 cm / 25 cm2培养瓶 | 4.4 | 62 ng | 15 ± 5 µl | 400 µl | 4 ml | 4.4 ml |
10 cm / 75 cm2培养瓶 | 10.5 | 147 ng | 40 ± 10 µl | 500 µl | 10 ml | 10.5 ml |
表2.1nM siRNA时各种细胞培养容器的推荐转染条件
2 疑难解答
问题 | 解决建议 |
较低的沉默效率 | 增加每孔中siRNA浓度。 |
增加每孔中RNAFit的量。 | |
检测转染24h~96h的不同时间点的沉默效率。 | |
用opti-MEM稀释siRNA。 | |
确保贴壁细胞在转染当天汇合度达到30-50%。对于小细胞和生长缓慢的细胞类型,每孔中接种约2倍数量的细胞以达到足够的汇合度。 | |
确认所有试剂是否不含RNase。 | |
确保siRNA是高质量的(PAGE纯化和脱盐)。 | |
确认siRNA双链体的浓度和退火条件。 | |
将转染期间的培养基体积减少一半并低速离心培养板(180g,5分钟)。 4小时后,加入0.5毫升培养基。 | |
细胞毒性 | 通过在转染后4至6小时更换培养基或简单地向培养基中添加新鲜培养基,减少RNAFit/ siRNA复合物与细胞的孵育时间。 |
减少转染试验中使用的RNAFit的体积。 | |
核实沉默靶基因后是否不影响细胞活力。 |
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