产品详情
文献和实验
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保质期 ：一年
供应商 ：钦诚生物
保存条件 ：4°保存
规格 ：50次
本产品是在miRNAout基础上开发的柱式升 级产品，是目前国内外市场上最快速最简单的小 RNA 分离纯化产品。它具有 下列特点：1. 一步法直接分离纯化小 RNA，比两步法（先分离总 RNA 和再纯化其 中的小 RNA）和 PAGE 电泳回收法更简单。得到的小 RNA 长度大部 分在 200 nt 以下，包括 5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、 pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 等。
2. 柱式操作，比 miRNAout 更加简单快捷，整个过程只需要十多分钟。
3. 适用范围广，可以用于动物组织、血液及部分植物组织等实验材料。
4. 小 RNA 纯净，OD260/280 一般都在 1.9 以上。
5. 产率一般为 20-40 ug/100 mg 动物组织。
6. 无基因组 DNA 的污染。
7. 可用于 RT-PCR、miRNA 标记、microarray 等后续实验。
使用方法 由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理 100mg 左右的各种 组织，可以在 1.5 mL 塑料离心管中。如果处理样品量大，请分成很多相当于 微量提取的量进行，最后再收集在一起。
1. 新鲜配制裂解液。将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合，然后根据组织 细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液 A 和溶液 B 混合后 必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每 10 平方厘米细胞中加入 1 mL 新鲜配制 的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每 1-5×106悬浮细胞中加入 1 mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果 是 fibroblasts 或 carcinoma cell，1 mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用 量不要超过 1×106个细胞。
c) 对新鲜的动物或植物实体组织：匀浆法：先将剪切成小块新鲜组织或液氮 保存的组织放入 10 mL 或 15 mL 塑料离心管中，每 50-100 mg 组织加 1 mL 新鲜配制的裂解液，用剪切式匀浆机匀浆 30 秒左右。对肝、脾、 胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的 DNA），建 议组织的使用量不要超过 50 mg/ mL 裂解液，否则十分容易产生 DNA 污染。液氮研磨法：将组织在液氮中研磨成粉，然后转移到新配制的裂解 液中，震荡混匀。
d) 对在 RNALOCKER等非冻型保存液中保存的动物或植物实体组织组织：先用 纸吸去 RNALOCKER液体后再剪切成小块，再按新鲜实体组织的处理方法处 理。 2. 将裂解物转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管中，然后加入 0.2 倍体积 的自备氯仿(1 mL 裂解物需 0.2 ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均 30 秒。
3. 12000-15000 g 室温离心 3-5 分钟。
4. 将上清液（约 0.6-0.8 mL）转移到广口的离心吸附柱中。注意：离心后 下层有机相和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质 和 DNA 污染。为保险起见，可以留下 100 uL 上清液不取。同时吸取上 清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状 DNA。不要使 用专门吸附小 RNA 的窄口离心吸附柱。
5. 12000-15000 g 室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大 RNA 及 DNA 将与离心吸附柱的膜结合，小 RNA 将存在于穿透液中。但由于离心吸附 柱的最大吸附能力为 40 ug 动物 RNA，20 ug 植物 RNA，所以如果样品 中的大 RNA 含量高于上面数值，则需要减少上样量，否则穿透液中将同 时含有大 RNA 和小 RNA。如果不减少上样量，也可以将穿透液再次重复 上柱以去除大 RNA。由于此时离心吸附柱已经吸附了大 RNA，所以需要 提前对离心吸附柱进行预处理（具体步骤见本手册最后的附录）。
6. 在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等体积的溶液 C，混匀。此时溶 液的总体积约 1.5 mL。
7. 先转移约 0.75mL 到窄口的离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离心半 分钟，弃收集管中的穿透液。
8. 将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离心 半分钟，弃收集管中的穿透液。
9. 加 0.7mL miRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离 心半分钟，弃穿透液。
10. 加 0.3mL miRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离 心半分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。
11. 12000-15000 g 室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则 残留的 miRNA 专用洗柱液会影响 miRNA 的使用。
12. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入30-50uL RNA 洗脱液，室温放置 3-5 分钟。
13. 12000-15000 g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 miRNA 样品，可 以立即使用或存放于-80℃待用。
附录：宽口离心吸附柱反复上样去除大 RNA 的流程 1. 将结合有大RNA和DNA的宽口离心吸附柱中加入0.1mL自备的超纯水, 12000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集液。 2. 再加 0.1mL 自备的超纯水，重复上步一次。 3. 将第 5 步的得到、需要进一步去除其中大 RNA 和 DNA 污染的穿透液直 接上柱，12000-15000 g 室温离心半分钟，收集穿透液（此穿透液含小 RNA）。 4. 如果大 RNA 已经去干净，可以直接进入第 6 步。一般样品只需要额外处 理一次就可以去除全部的大 RNA 污染。
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